Итаконовая кислота (ITACONIC ACID)

Итаконовая кислота (ITACONIC ACID)

CAS No. : 97-65-4
EC No. : 202-599-6

Synonyms:
2-Methylidenebutanedioic acid; 2-Methylenesuccinic acid; Methylenesuccinic acid[1]; 1-Propene-2-3-dicarboxylic acid; IA; Itaconic acid; 97-65-4; 2-Methylenesuccinic acid; METHYLENESUCCINIC ACID; Methylenebutanedioic acid; itaconate; Propylenedicarboxylic acid; 2-methylidenebutanedioic acid; Butanedioic acid, methylene-; 2-Propene-1,2-dicarboxylic acid; Succinic acid, methylene-; 2-methylenebutanedioic acid; Poly(itaconic acid); Itaconic acid polymers; Itaconic acid polymer; butanedioic acid, 2-methylene-; Methylenesuccinic acid polymers; Poly(2-methylenesuccinic acid); EINECS 202-599-6; MFCD00004260; 2-Methylene-Succinic Acid; Butanedioic acid, methylene-, homopolymer; CHEMBL359159; CHEBI:30838; NSC3357; Succinic acid, methylene- (8CI); Q4516562YH; Itaconic acid, 99+%; DSSTox_CID_6608; DSSTox_RID_78161; 2-methylenebutanedioate; DSSTox_GSID_26608; 25119-64-6; CAS-97-65-4; Methylenesuccinate; Methylenebutanedioate; ITACONIC ACID; Succinic acid, methylene-, polymers; 2-Methylenesuccinate; Methylensuccinic Acid; Propylenedicarboxylate; ACMC-1CFCS; Itaconic acid, >=99%; bmse000137; Probes1_000076; Probes2_000247; EC 202-599-6; 2-Methylenesuccinic acid #; NCIStruc1_001783; 2-Methylidenebutanedioic acid; 2-Methylenesuccinic acid; Methylenesuccinic acid[1]; 1-Propene-2-3-dicarboxylic acid; IA; Itaconic acid; 97-65-4; 2-Methylenesuccinic acid; METHYLENESUCCINIC ACID; Methylenebutanedioic acid; itaconate; Propylenedicarboxylic acid; 2-methylidenebutanedioic acid; Butanedioic acid, methylene-; 2-Propene-1,2-dicarboxylic acid; Succinic acid, methylene-; 2-methylenebutanedioic acid; Poly(itaconic acid); Itaconic acid polymers; Itaconic acid polymer; butanedioic acid, 2-methylene-; Methylenesuccinic acid polymers; Poly(2-methylenesuccinic acid); 2-methylene-butanedioic acid; NCIOpen2_004822; SCHEMBL21523; 2-Propene-1,2-dicarboxylate; DTXSID2026608; CTK3I6894; Itaconic acid, analytical standard; ZINC895261; LMFA01170063; Propylenedicarboxylic acid 97-65-4; s3095; STL163322; AKOS000118895; 2-Hydroxy-3-Naphthoyl-2-Naphthylamine; Butanedioic acid,ethylidene-,(E)-(9ci); Succinic acid, methylene-, polymers (8CI); 2-METHYLENE,1,4-BUTANEDIOIC ACID (ITACONIC ACID)

Итаконовая кислота

Итаконовая кислота или метилиден янтарная кислота - это органическое соединение. Эта дикарбоновая кислота представляет собой белое твердое вещество, растворимое в воде, этаноле и ацетоне. Исторически итаконовая кислота была получена путем дистилляции лимонной кислоты, но в настоящее время ее получают путем ферментации. Название итаконовая кислота было изобретено как анаграмма аконитовой кислоты, другого производного лимонной кислоты.

Производство
С 1960-х годов его производят в промышленности путем ферментации углеводов, таких как глюкоза или патока, с использованием таких грибов, как Aspergillus itaconicus или Aspergillus terreus.
Для A. terreus итаконатный путь в основном выяснен. Общепринятым путем для итаконата является гликолиз, цикл трикарбоновых кислот и декарбоксилирование цис-аконатата до итаконата через цис-аконитат-декарбоксилазу.

Головной гриб Ustilago maydis использует альтернативный путь. Цис-аконитат превращается в термодинамически предпочтительный транс-аконитат через аконитат-Δ-изомеразу (Adi1). транс-аконитат дополнительно декарбоксилируется до итаконата транс-аконитат-декарбоксилазой (Tad1).
Итаконовая кислота также продуцируется в клетках макрофагального происхождения. Было показано, что итаконат является ковалентным ингибитором фермента изоцитратлиазы in vitro. Таким образом, итаконат может обладать антибактериальной активностью против бактерий, экспрессирующих изоцитратлиазу (таких как Salmonella enterica и Mycobacterium tuberculosis).
Однако клетки макрофагального клона должны «заплатить цену» за производство итаконата, и они теряют способность выполнять фосфорилирование митохондриального субстрата.

Лабораторный синтез
Сухая перегонка лимонной кислоты дает итаконовый ангидрид, который подвергается гидролизу до итаконовой кислоты.

Реакции
При нагревании итаконовый ангидрид изомеризуется в ангидрид цитраконовой кислоты, который может быть гидролизован до цитраконовой кислоты (2-метилмалеиновой кислоты).
Этапы превращения лимонной кислоты в цитраконовую кислоту с помощью итаконовой и аконитовой кислот.
Частичное гидрирование итаконовой кислоты над никелем Ренея дает 2-метилянтарную кислоту.
Итаконовая кислота в основном используется в качестве сомономера при производстве акрилонитрил-бутадиен-стирольных и акрилатных латексов с применением в бумажной и архитектурной промышленности покрытий.

Свойства и применение итаконовой кислоты
Итаконовая кислота представляет собой белый кристаллический порошок, обладающий гигроскопичностью и специфическим запахом. Его температура плавления составляет 167–168 ° C, а температура кипения - 268 ° C. Растворимость в воде составляет 83,1 г / л, а раствор (80 мг / л) итаконовой кислоты в чистой воде имеет pH 2,0. Плотность итаконовой кислоты 1,63 (20 ° C). Значения pKa итаконовой кислоты, ее двух стадий диссоциации, составляют 3,84 и 5,55 (25 ° C). Константы равновесия K1 = 1,4 · 10−4 и K2 = 3,6 · 10−6 (25 ° C).

Итаконовая кислота в основном используется в производстве пластмасс и красок. Это ненасыщенная дикарбоновая кислота, которую можно легко включить в полимеры и использовать в концентрации 1–5% (мас. / Мас.) В качестве сомономера в полимерах. Полимеризованные метиловые, этиловые или виниловые эфиры итаконовой кислоты используются в качестве пластмасс, клеев, эластомеров и покрытий. Сополимеры стирола и бутадиена, содержащие итаконовую кислоту, дают резиноподобные смолы с превосходной прочностью и гибкостью, а также водонепроницаемые покрытия с хорошей электроизоляцией. Другие области применения - синтетические волокна, решетки, моющие и чистящие средства. С другой стороны, некоторые моно- и диэфиры частично замещенной итаконовой кислоты обладают противовоспалительным или обезболивающим действием, и особый новый рынок открылся для использования в областях фармацевтики итаконовой кислоты. В качестве подкислителя используется небольшое количество итаконовой кислоты.

Итаконовая кислота (2-метилен янтарная кислота, 1-пропен-2–3-дикарбоновая кислота) представляет собой ненасыщенную слабую дикарбоновую кислоту (pKa = 3,83 и 5,41), обнаруженную в 1837 году как продукт термического разложения лимонной кислоты. Наличие сопряженной двойной связи метиленовой группы делает возможной полимеризацию как путем присоединения, так и конденсации. Также возможна этерификация двух карбоксильных групп разными сомономерами (Kuenz et al., 2012). Эти разнообразные свойства привели к множеству применений в фармацевтической, архитектурной, бумажной, лакокрасочной и медицинской отраслях, таких как пластмассы, смолы, краски, синтетические волокна, пластификаторы и детергенты. В последнее время применение итаконовой кислоты стало применяться в стоматологии, офтальмологии и доставке лекарств (Hajian and Yusoff, 2015). Полимеры итаконовой кислоты могут даже заменить полиакриловую кислоту на нефтяной основе, рынок которой оценивается в несколько миллиардов долларов (Saha et al., 2019). Неудивительно, что в 2004 году Министерство энергетики США включило итаконовую кислоту в число 12 самых многообещающих строительных блоков для экономики, основанной на биотехнологиях (Werpy and Petersen, 2004).

Мало что известно о причинах, по которым грибы производят итаконат. Как и другие органические кислоты, как указано выше, итаконовая кислота также может служить подкислителем окружающей среды и, таким образом, обеспечивать селективное преимущество для кислотоустойчивого A. terreus перед другими микроорганизмами. Однако итаконовая кислота также обладает явными ингибирующими свойствами: в макрофагах млекопитающих бактериальная инфекция вызывает индукцию гена, кодирующего цис-аконитат-декарбоксилазу, что приводит к образованию итаконовой кислоты, которая ингибирует метаболизм бактерий как часть иммунного ответа. Эффект приписывают ингибированию сукцинатдегидрогеназы и изоцитратлиазы (McFadden et al., 1971), последняя является ключевым ферментом глиоксилатного цикла, необходимым для выживания патогенов внутри хозяина. В свою очередь, несколько штаммов этих бактерий эволюционировали и стали способны разлагать итаконат (Sasikaran et al., 2014). Итаконовая кислота также индуцирует фактор транскрипции, необходимый для защиты от окислительного и ксенобиотического стресса, а также для ослабления воспаления (Kobayashi et al., 2013; Bambouskova et al., 2018). Существует ли аналогичная функция итаконата в грибах, продуцирующих его, еще не изучено.

Путь биосинтеза итаконовой кислоты напоминает путь лимонной кислоты, причем последняя кислота является прямым предшественником первой. Единственное отличие состоит в том, что лимонная кислота в A. terreus далее метаболизируется через цис-аконитат до итаконата с помощью цис-аконитат-декарбоксилазы (Bonnarme et al., 1995). С этой целью цисаконитат переносится из митохондрий с помощью специфического антипортера в обмен на оксалоацетат (Li et al., 2011a, b). Итаконовая кислота, образующаяся при декарбоксилировании цис-аконитата, наконец, секретируется из мицелия с помощью специфического переносчика клеточной мембраны. Гены, кодирующие эти три фермента и четвертый, кодирующий фактор транскрипции, составляют «кластер итаконатных генов» в геноме A. terreus, в то время как этот кластер заметно отсутствует у A. niger. Несмотря на то, что было протестировано несколько продуцентов итаконата, патогенный к растениям Basidiomycete Ustilago maydis (гриб кукурузной головни) - и, в частности, его стабильный с низким уровнем pH родственник Ustilago cynodontis (Hosseinpour Tehrani et al., 2019b) - кажется, единственный с разумным шанс стать еще одним организмом промышленной платформы (Hosseinpour Tehrani et al., 2019a). Ustilago разработал альтернативный биохимический путь синтеза итаконата, поскольку цис-аконатат превращается в термодинамически предпочтительный транс-аконитат под действием аконитат-дельта-изомеразы. Затем транс-аконитат декарбоксилируется до итаконата транс-аконитат-декарбоксилазой.

Производство итаконовой кислоты процессами ферментации
Итаконовая кислота производится при периодической ферментации в процессе, во многом аналогичном процессу лимонной кислоты. Источник углерода должен быть в легко метаболизируемой форме (сируппа глюкозы, патока и неочищенный гидролизат крахмала) и разбавлен примерно до 10% масс. Ограничение фосфатов необходимо для ограничения роста. Некоторые следы металлов также должны быть в ограниченных количествах, и это обычно достигается обработкой среды гексацианоферратом или добавлением меди. Уровень pH составляет от 2,8 до 3,2. Более низкие значения pH способствуют образованию побочных продуктов. Урожайность 50–60% от теоретической достигается за 8–10 дней [5].

В течение многих лет, похоже, почти не было интереса к исследованию производства итаконовой кислоты, и этот процесс оставался неизменным с момента его появления. Сегодня ситуация иная. Итаконовая кислота внесена в список Министерства энергетики США (DOE) как один из 12 строительных блоков с самым высоким потенциалом, который может быть произведен промышленной биотехнологией [11]. Его текущее низкое производство ограничивает его использование. Стратегии метаболической инженерии, как метод повышения урожайности, еще не применялись с A. terreus, так как они были ограничены плохими знаниями генетики биосинтеза итаконовой кислоты. Однако недавно исследователи из Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek (TNO), Нидерланды, идентифицировали три гена, которые имеют решающее значение для продукции итаконовой кислоты A. terreus [15]. Помимо новых знаний о генетике биосинтеза, разработка новых технологий ферментации и более совершенный контроль биопроцессов привели к возобновлению интереса к улучшению производства итаконовой кислоты. Новые стратегии периодического действия с подпиткой и непрерывные процессы с использованием иммобилизованных культур разрабатываются и исследуются.

Итаконовая кислота - это дикарбоновая кислота, которая используется в промышленности в качестве предшественника полимеров, используемых в пластмассах, клеях и покрытиях. Новые области применения полимеров на основе итаконовой кислоты активно исследуются. Производство итаконовой кислоты на 2001 год оценивается в 15 000 тонн. Интерес к этому химическому веществу возобновился, поскольку промышленность ищет заменители химикатов, полученных из нефти. Практически вся итаконовая кислота производится ферментацией определенных штаммов A. terreus. Производство итаконовой кислоты является дальнейшим нарушением цикла Кребса, цитрат обычно превращается в цис-аконитат, который по неизвестным причинам у некоторых организмов декарбоксилируется в итаконитат, который не играет известной метаболической роли в клетке.

Тот факт, что различные штаммы Aspergillus и грибов в целом могут переключать метаболические пути на перепроизводство и секрецию полезных химических веществ, в сочетании с тем фактом, что эти организмы могут расти на остатках таких процессов, как производство сахара и этанола, открывает возможность инженерной мысли. пути производства высокоценных химикатов с помощью «зеленых», низко загрязняющих и исключающих отходы процедур.

Производство итаконовой кислоты
Итаконовая кислота является примером дикарбоновой ненасыщенной кислоты. Эти кислоты используются в качестве строительных блоков для большого количества соединений, таких как смолы, краски, пластмассы и синтетические волокна (акриловый пластик, суперпоглощающие вещества и средства против накипи) [67]. Промежуточный цис-аконитат CAC ферментативно перерабатывается цис-аконитатдегикарбоксилазой (CadA) с образованием итаконовой кислоты [68]. В промышленных масштабах наиболее изученным организмом для ферментативного производства итаконовой кислоты является Aspergillus terrus. Путь биосинтеза итаконовой кислоты похож на биосинтез цитрата, где поток САС используется для каталитического превращения цис-аконитата в итаконовую кислоту. Таким образом, цитрат синтезируется из оксалоацетата и ацетил-КоА, а оксалоацетат синтезируется из пирувата путем анаплероза, который начинается с пирувата, который является конечным продуктом гликолиза (рис. 13.17).

Итаконовая кислота (метилен янтарная кислота, C5H6O4) (рис. 17) представляет собой белый бесцветный кристаллический гигроскопичный порошок, растворимый в воде, этаноле и ацетоне. Это ненасыщенная дипротонная кислота, уникальные химические свойства которой связаны с конъюгацией одной из двух групп карбоновой кислоты с метиленовой группой.
Итаконовая кислота была открыта Баупом в 1837 году как продукт пиролитической перегонки лимонной кислоты. Название itaconic было придумано как анаграмма aconitic.

Итаконовая кислота образуется при ферментации некоторых сахаров. В 1929 году Киношита впервые показал, что кислота является продуктом метаболизма Aspergillus itaconicus. Производное итаконовой кислоты (транс-фенилитаконовая кислота) было выделено из другого природного источника (Artemisia argyi).
Путь биосинтеза итаконовой кислоты из глюкозы аналогичен пути биосинтеза лимонной кислоты, который происходит через гликолитический путь и анаплеротическое образование оксалоацетата за счет фиксации CO2 и через цикл TCA (рис. 2). Итаконовая кислота образуется цитозольным ферментом аконитат-декарбоксилазой из цис-аконитовой кислоты. Другой путь биосинтеза от пирувата через цитрамаловую, цитраконовую и итартаровую кислоты также приводит к итаконовой кислоте (рис. 18).
В отличие от некоторых других органических кислот (например, лимонной, изоазонной, молочной, фумаровой и l-яблочной кислоты) итаконовая кислота используется исключительно в непищевых целях, особенно в полимерной промышленности. Производные итаконовой кислоты используются в медицине, косметике, смазках, загустителях и гербицидах (например, замещенных анилидах итаконовой кислоты).

Итаконовая кислота производится исключительно путем периодической ферментации грибов под водой. Aspergillus terreus использовался с 1940-х годов в процессе ферментации, который аналогичен процессу ферментации лимонной кислоты (см. «Лимонная кислота»), то есть требует избытка легко метаболизируемого сахара (глюкозный сироп, неочищенный гидролизат крахмала и декатионизированный меласса - до 200 гл-1 сахара), непрерывная аэрация, низкий начальный pH (от 3 до 5), достаточное количество азота, высокая концентрация сульфата магния (0,5%), низкий уровень фосфата для ограничения производства биомассы и ограничение по ионам металлов (цинк, медь и железо). Однако существует одно существенное различие в том, что чувствительность этого грибка к образующейся кислоте, в отличие от A. niger, требует поддержания pH на уровне 2,8–3,1 на протяжении всего процесса ферментации, чтобы получить большое количество кислоты. В настоящее время опубликованный выход итаконовой кислоты составляет около 85% от теоретического, при этом концентрация продукта составляет около 80 г / л во время культивирования при 39–42 ° C в течение 8–10 дней. Извлечение итаконовой кислоты осуществляется сначала путем отделения биомассы грибов фильтрованием, с последующим выпариванием, обработкой активированным углем и кристаллизацией и перекристаллизацией. Фактические рынки сбыта итаконовой кислоты в настоящее время ограничены, поскольку грибковая ферментация проводится с относительно высокими затратами. Новые биотехнологические подходы, такие как опубликованные методы иммобилизации, программы скрининга других продуцирующих организмов (таких как дрожжи) и генная инженерия A. terreus (аннотированная последовательность генома штамма A terreus NIH 2624 была опубликована) или A. niger, может привести к более высокому производству итаконовой кислоты. Кроме того, использование альтернативных субстратов может снизить затраты и, таким образом, открыть рынок для новых и расширенных областей применения этой кислоты.

Эта ценная кислота может вырабатываться несколькими организмами, такими как Candida sp., Pseudozyma antarctica и несколькими видами Aspergillus [49], но двумя наиболее распространенными используемыми микроорганизмами являются Aspergillus terreus, используемый в промышленных процессах, и Ustilago maydis, который является в настоящее время активно исследуется как возможный промышленный продукт. Кислота коммерчески используется в качестве сомономера в некоторых синтетических каучуках (стирол-бутадиеновой и нитриловой) и в качестве пластификатора в рецептурах других полимеров. Его производство традиционно осуществляется с использованием сахара в качестве сырья по технологии, которая была разработана в первой половине 20 века [50], но не была разработана из-за низкой конкуренции кислоты с нефтехимической акриловой кислотой. С развитием интегрированных и устойчивых процессов возобновляется интерес к биопроизводству итаконовой кислоты.

Итаконовая кислота производится с использованием A. terreus из простых сахаров. Производство может осуществляться с использованием глубинной твердой ферментации, а типичные субстраты, такие как меласса, получают из производства сахара. Принятый механизм производства итаконовой кислоты состоит из превращения цис-аконитата в итаконат путем ферментативно катализируемого декарбоксилирования [53] (рис. 18.6).

Цис-аконитат является частью цикла Кребса, так что этот процесс является аэробным, фактически чрезвычайно зависимым от кислорода, как определил Гьямера [54]. Важны кальций и цинк [55], так же как медь [56], и поддержание низкого уровня фосфатов очень важно [53]. Идеальная температура - 40 ° C, а pH необходимо снизить до 2, чтобы начать производство. Процесс является чрезвычайно аэробным в течение первых 72 часов процесса с выходом около 60% по весу (продукт / субстрат) [55]. Конечная концентрация колеблется от 30 до 60 г / л в зависимости от субстрата [56–58]. После ферментации бульон осветляется, и свободная кислота может быть сконцентрирована и кристаллизована, но если в процессе используется основание для частичной нейтрализации (что может увеличить выход), необходимо удалить катионы, используемые при кристаллизации.

Производство итаконовой кислоты в SSF все еще неуловимо: отчеты описывают производство порядка 5–40 г / кг сухого субстрата [59]. В некоторых отчетах, описывающих более высокие урожаи, около 60%, фактически используется подложка, пропитанная питательным раствором [60,61]. Сравнение синтетической жидкой и твердой сред показало, что процесс в SSF имеет более низкую конверсию (16–23%), чем процесс в погруженном состоянии (около 60%). Пока нет определенного объяснения более низкой продуктивности в твердом состоянии, но, похоже, есть избыток фосфата или недостаток основных питательных веществ в большинстве твердых субстратов, протестированных на восстановление итаконовой кислоты.

Итаконовая кислота, впервые полученная путем перегонки лимонной кислоты, с 1960 года производится путем ферментации углеводов A. terreus (Mitsuyasu et al., 2009; Hajian and Yusoff, 2015). Итаконовая кислота применялась во многих отраслях промышленности, причем крупнейшими производителями в мире являются США, Япония, Россия и Китай (Global Industry Analysts Inc., 2011).

В 1950-х годах итаконовая кислота использовалась в промышленных клеях. В то время итаконовая кислота использовалась в промышленных масштабах, и требовалось ее большое количество. Он использовался в качестве моющего средства и в шампунях, а также в пластмассах, эластомерах, стекловолокне и в процессе покрытия ковров и обложек книг (Mitsuyasu et al., 2009; Jin et al., 2010). Кроме того, итаконовая кислота может также использоваться в качестве искусственных драгоценных камней и синтетических стекол (Kin et al., 1998). В последнее время применение соединения достигло биомедицинских областей, таких как офтальмология, стоматология и доставка лекарств (Hajian and Yusoff, 2015).

В последние годы несколько исследований были сосредоточены на улучшении и оптимизации производства итаконовой кислоты из A. terreus. Биотехнологические аспекты метаболических путей итаконовой кислоты и параметры производственного процесса были рассмотрены Клементом и Бюхсом (2013). Что касается производства, Amina et al. (2013) получили итаконовую кислоту, используя масляный побочный продукт жмыха семян ятрофы куркас, в то время как Li et al. (2011), Хуанг и др. (2014) и van der Straat et al. (2014) изучали производство итаконовой кислоты с помощью методов генной инженерии. В этом процессе были выявлены соответствующие пути и разработаны новые платформы для производства микробов, способствующие усиленному производству итаконовой кислоты. Кроме того, снижение производственных затрат является важным аспектом для производителей итаконовой кислоты, либо за счет оптимизации процессов, либо за счет использования экономически выгодного сырья.

Итаконовая кислота или метиленянтарная кислота - это высокоценный платформенный химикат, который находит применение в полимерной промышленности, очистке сточных вод и в секторе ионообменной хроматографии (Willke and Vorlop, 2001). Его можно преобразовать в 3-метилтетрагидрофуран, который имеет превосходные характеристики выбросов и горения по сравнению с бензином. Промышленное производство итаконовой кислоты осуществляется с помощью A. terreus с использованием глюкозы в качестве единственного источника углерода. Производство итаконовой кислоты метаболически модифицированной Neurospora crassa с использованием лигноцеллюлозной биомассы было оценено Zhao et al. (2018). Ген декарбоксилазы цис-аконитовой кислоты гетерологично экспрессировался в N. crassa для синтеза итаконовой кислоты. Созданный штамм был способен продуцировать итаконовую кислоту (20,41 мг / л) непосредственно из лигноцеллюлозной биомассы.

О производстве итаконовой кислоты из гидролизата биомассы с использованием штаммов Aspergillus сообщили Jiménez-Quero et al. (2016). Кислотные и ферментативные гидролизаты оценивали на производство итаконовой кислоты. Максимальное производство итаконовой кислоты (0,14%) наблюдалось при проведении глубокой ферментации с гидролизатом кукурузных початков A. oryzae. Исследование показывает возможность SSF биомассы для производства итаконовой кислоты.

Klement et al. (2012) оценили производство итаконовой кислоты Ustilago maydis из гемицеллюлозной фракции предварительно обработанной древесины бука. Одним из преимуществ U. maydis является то, что штамм растет как дрожжеподобные одиночные клетки и может выжить при высоком осмотическом стрессе. Исследование показало, что при мягких условиях предварительной обработки U. maydis будет многообещающим кандидатом для производства итаконовой кислоты. Для улучшения производства итаконовой кислоты необходимо выполнить точную настройку условий предварительной обработки.

Производство итаконовой кислоты
Итаконовая кислота является примером дикарбоновой ненасыщенной кислоты. Эти кислоты используются в качестве строительных блоков для большого количества соединений, таких как смолы, краски, пластмассы и синтетические волокна (акриловый пластик, суперпоглощающие вещества и средства против накипи) [67]. Промежуточный цис-аконитат CAC ферментативно обрабатывается цис-аконитатдегикарбоксилазой (CadA) с образованием итаконовой кислоты [68]. В промышленных масштабах наиболее изученным организмом для ферментативного производства итаконовой кислоты является Aspergillus terrus. Путь биосинтеза итаконовой кислоты похож на биосинтез цитрата, где поток САС используется для каталитического превращения цис-аконитата в итаконовую кислоту. Таким образом, цитрат синтезируется из оксалоацетата и ацетил-КоА, а оксалоацетат синтезируется из пирувата путем анаплероза, который начинается с пирувата, который является конечным продуктом гликолиза (рис. 13.17) [69].

Итаконовая кислота (IA) может использоваться:
• В качестве сомономера при полимеризации полиакрилонитрила (ПАН) для ускорения термоокислительной стабилизации полимера. [1]
• В сочетании с акриламидом с образованием (поли [акриламид-со (итаконовая кислота)]) для синтеза биоразлагаемых суперабсорбирующих полимеров. [2]
• Синтезировать полиэфирный композит на биологической основе в текстильной промышленности.

Итаконовая кислота представляет собой ненасыщенную дикарбоновую кислоту, которая имеет высокий потенциал в качестве биохимического строительного блока, поскольку ее можно использовать в качестве мономера для производства множества продуктов, включая смолы, пластмассы, краски и синтетические волокна. Некоторые виды Aspergillus, такие как A. itaconicus и A. terreus, демонстрируют способность синтезировать эту органическую кислоту, а A. terreus может выделять значительные количества в среду (> 80 г / л). Однако по сравнению с процессом производства лимонной кислоты (титры> 200 г / л) достигнутые титры все еще низкие, а весь процесс дорогостоящий, поскольку для оптимальной производительности требуются очищенные субстраты. Итаконат образуется в результате ферментативной активности цис-аконитат-декарбоксилазы (CadA), кодируемой геном cadA в A. terreus. Клонирование гена cadA в гриб A. niger, продуцирующий лимонную кислоту, показал, что итаконовую кислоту можно продуцировать и в другом организме-хозяине. В этом обзоре будет описано текущее состояние и последние достижения в понимании молекулярных процессов, ведущих к биотехнологическому производству итаконовой кислоты.

Итаконовая кислота (2-метилиденбутандиовая кислота) представляет собой ненасыщенную дикарбоновую кислоту. Он имеет широкий спектр применения в промышленном производстве смол и используется в качестве строительного блока для акриловых пластиков, акрилатных латексов, суперабсорбентов и агентов против образования накипи (Willke and Vorlop, 2001; Okabe et al., 2009). С 1960-х годов производство итаконовой кислоты достигается путем ферментации с Aspergillus terreus на сахаросодержащих средах (Willke and Vorlop, 2001). Хотя также другие микроорганизмы, такие как Ustilago zeae (Haskins et al., 1955), U. maydis, Candida sp. (Tabuchi et al., 1981) и Rhodotorula sp. (Kawamura et al., 1981), как было обнаружено, продуцируют итаконовую кислоту, A. terreus по-прежнему является доминирующим хозяином-продуцентом, потому что до сих пор только выведенные штаммы этого вида могут достигать уровней до 80–86 г / л (Okabe et al. ., 2009; Kuenz et al., 2012). Начиная с 1990-х годов, итаконовая кислота как возобновляемый материал вызывает большой интерес. В настоящее время мировые производственные мощности итаконовой кислоты, как ожидается, составят около 50 тыс. Тонн в год, при этом спрос на нее составит около 30 тыс. Тонн (Shaw, 2013, Itaconix Corporation, личное сообщение). Это особенно интересно для производства полимеров, потому что в будущем он может функционировать как заменитель акриловой и метакриловой кислоты, используемой для производства пластмасс (Okabe et al., 2009). Однако эти приложения требуют еще более низкой цены на исходный материал. Недавно был проведен обзор современных знаний о биотехнологическом производстве итаконовой кислоты (Willke and Vorlop, 2001; Okabe et al., 2009). Последний обзор посвящен промышленному производству итаконовой кислоты и применению этого продукта. Поэтому в этом отчете мы сосредоточены на последних достижениях с акцентом на биохимию процесса и новые цели генной инженерии. Для рационального улучшения штаммов важно понимать основные биологические концепции и биохимические пути, ведущие к производству этой важной органической кислоты в микроорганизмах.

Путь биосинтеза
Киношита (1932) признал, что нитчатый гриб способен продуцировать итаконовую кислоту, и, следовательно, описал этот вид как A. itaconicus. Биосинтез итаконовой кислоты долгое время горячо обсуждался, потому что не было ясно, возникает ли итаконовая кислота по пути, включающему части цикла трикарбоновых кислот (ТСА), или альтернативным путем через цитрамалат или конденсацию ацетил-КоА.

Бентли и Тиссен (1957a) предложили путь биосинтеза итаконовой кислоты, который изображен на рисунке 1. Начиная с сахарного субстрата, такого как глюкоза, молекулы углерода перерабатываются посредством гликолиза в пируват. Затем путь расщепляется, и часть углерода метаболизируется до ацетил-КоА, высвобождая молекулу диоксида углерода. Другая часть превращается в оксалоацетат, так что ранее высвобожденная молекула диоксида углерода снова включается. На первых этапах цикла лимонной кислоты образуются цитрат и цис-аконитат. На последнем этапе, единственном этапе, посвященном пути итаконовой кислоты, цис-аконитат-декарбоксилаза (CadA) образует итаконовую кислоту, выделяющую диоксид углерода. Этот путь был подтвержден трассирующими экспериментами с субстратами, меченными 14C и 13C (Bentley and Thiessen, 1957a; Winskill, 1983; Bonnarme et al., 1995), а также была определена необходимая ферментативная активность (Jaklitsch et al., 1991).

Образование карбоновых кислот, таких как лимонная и итаконовая кислота, включает перемещение промежуточных метаболитов между различными внутриклеточными компартментами и использование различных ферментативных возможностей соответствующего компартмента. В случае итаконовой кислоты компартментализация пути анализировалась фракционированными клеточными экстрактами, различая ферментативную активность митохондрий от цитозольного фермента. Было обнаружено, что ключевой фермент пути, CadA, находится не в митохондриях, а в цитозоле (Jaklitsch et al., 1991), тогда как ферменты, предшествующие этому пути, а именно цитратсинтаза и аконитаза, находятся в митохондриях. митохондрии. Однако остаточный уровень активности аконитазы и цитратсинтазы также обнаруживается в цитозольной фракции. Предлагаемый механизм заключается в том, что цис-аконитат транспортируется через малат-цитратный антипортер в цитозоль (Jaklitsch et al., 1991). Однако до сих пор не было показано, использует ли цис-аконитат митохондриальный малат-цитратный антипортер или другой митохондриальный белок-носитель для перемещения в цитозоль.

Помимо A. terreus, итаконовая кислота, как известно, продуцируется также другими грибами, такими как U. zeae (Haskins et al., 1955), U. maydis (Haskins et al., 1955; Klement et al., 2012), Candida sp. . (Tabuchi et al., 1981) и Rhodotorula sp. (Кавамура и др., 1981). Дальнейших исследований основополагающих принципов реакции, приводящих к образованию итаконовой кислоты у этих видов, не проводилось. Однако недавние данные (Strelko et al., 2011; Voll et al., 2012) указывают на то, что активность CadA составляет общий путь к образованию итаконовой кислоты в природе. Совсем недавно итаконовая кислота была обнаружена в клетках млекопитающих, где она была обнаружена в клетках, происходящих от макрофагов (Strelko et al., 2011). Эти клетки также обладают активностью CadA и способны образовывать итаконовую кислоту de novo. Но до сих пор в клетках млекопитающих не было идентифицировано специфического гена, кодирующего эту ферментативную активность.

Однако физиологическая роль итаконовой кислоты в клетках млекопитающих до сих пор неизвестна. Стрелко и др. (2011) размышляют о роли итаконовой кислоты как ингибитора метаболических путей, поскольку она описывается как ингибитор ферментов. С одной стороны, известно, что итаконовая кислота ингибирует изоцитратлиазу (Williams et al., 1971; McFadden and Purohit, 1977), которая является важной частью глиоксилатного шунта и, таким образом, может действовать как антибактериальный агент. С другой стороны, итаконовая кислота может ингибировать фруктозо-6-фосфат-2-киназу (Sakai et al., 2004) и, таким образом, иметь прямое влияние на центральный углеродный метаболизм. На крысах было показано, что диета итаконатом приводит к снижению накопления висцерального жира из-за подавления гликолитического потока (Sakai et al., 2004).

Ферменты и гены, специфичные для пути итаконовой кислоты
Реакция, катализируемая декарбоксилазой цис-аконитовой кислоты, была описана еще в 1957 г. (Bentley and Thiessen, 1957a, b). Проведенные впоследствии эксперименты по мечению 13C и 14C (Winskill, 1983; Bonnarme et al., 1995) подтвердили схему реакции, изображенную на рисунке 2. Итаконовая кислота образуется в результате аллильной перегруппировки и декарбоксилирования из цис-аконитовой кислоты с удалением углерода C1 или C5 из исходная молекула лимонной кислоты (из-за симметрии молекулы).

Катаболизация итаконовой кислоты
Многое известно о биосинтезе итаконовой кислоты и основных ферментативных механизмах, но для полной биохимической картины определенного метаболита также необходимы знания о его деградации. К сожалению, информации о путях разложения итаконовой кислоты недостаточно. В клетках млекопитающих (морская свинка и печень крысы) было обнаружено, что итаконат превращается в итаконил-КоА (Adler et al., 1957) и далее процессируется с помощью цитрамалил-КоА (Wang et al., 1961) в пируват и ацетил- CoA. Таким образом, было обнаружено, что малонат оказывает ингибирующее действие, а добавление предотвращает разложение итаконовой кислоты (Adler et al., 1957). Первый этап этого пути деградации может катализироваться повсеместно распространенной сукцинил-КоА синтетазой (Adler et al., 1957; Nagai, 1963; Schürmann et al., 2011). Третий этап пути катализируется цитрамалил-КоА-лиазой, куда были клонированы гены из Chloroflexus aurantiacus (Friedmann et al., 2007) и Pseudomonas putida (Jain, 1996). Однако до сих пор не было идентифицировано последовательности белка и гена, которые могут катализировать вторую стадию пути деградации, которая представляет собой итаконил-КоА-гидратазу (Cooper and Kornberg, 1964).

Метаболическая инженерия пути итаконовой кислоты у A. terreus и A. niger
Уровни итаконовой кислоты, которые были достигнуты с A. terreus, в настоящее время ограничены примерно 85 г / л. Хотя это уже значительное количество, его нельзя сравнивать с производством лимонной кислоты, где титры более 200 г / л стабильно достигаются в промышленных процессах. Если перевести на производство итаконовой кислоты, должен быть достигнут максимальный теоретический титр около 240 г / л (Li et al., 2011). Эта цель может быть достигнута путем дальнейшего разведения существующих в настоящее время штаммов или целевой генной инженерии.

Было показано, что у A. terreus ген влияет на выработку итаконовой кислоты, которая является ключевым ферментом гликолиза. Известно, что 6-фосфофрукто-1-киназа ингибируется цитратом и аденозинтрифосфатом (АТФ). Однако было показано, что усеченная версия гена pfkA A. niger демонстрирует более высокий выход лимонной кислоты из-за пониженного ингибирования цитратом и АТФ (Capuder et al., 2009). Эта усеченная версия pfkA также оказывает положительное влияние на накопление итаконовой кислоты при экспрессии в A. terreus (Tevz et al., 2010). Другой инженерный подход связан с внутриклеточной подачей кислорода. Производство итаконовой кислоты требует непрерывной аэрации, и уже кратковременное прекращение подачи кислорода снижает выход итаконовой кислоты. Для снижения чувствительности к кислороду в A. terreus был экспрессирован ген гемоглобина из Vitreoscilla. Действительно, экспрессия этого гена приводит к увеличению продукции итаконовой кислоты. Кроме того, штаммы показали лучшее восстановление после прерывания аэрации (Lin et al., 2004).

Существует вероятность того, что генетический состав A. terreus недостаточно эффективен, чтобы поддерживать производство более высоких титров органических кислот. Следовательно, стратегия заключается в генетической инженерии пути биосинтеза итаконовой кислоты в другом организме-хозяине, который, как уже известно, поддерживает производство высоких титров органи