ПРОТЕАЗЫ

НОМЕР КАС: 9001-92-7

Протеаза (также называемая пептидазой или протеиназой) представляет собой фермент, который катализирует (увеличивает скорость реакции или «ускоряет») протеолиз, расщепляя белки на более мелкие полипептиды или отдельные аминокислоты и стимулируя образование новых белковых продуктов.
Они делают это, расщепляя пептидные связи в белках путем гидролиза, реакции, при которой вода разрывает связи. Протеазы участвуют во многих биологических функциях, включая переваривание белков, катаболизм белков (расщепление старых белков) и передачу клеточных сигналов.

В отсутствие функциональных ускорителей протеолиз был бы очень медленным, занимая сотни лет.
Протеазы можно найти во всех формах жизни и вирусах.
Они эволюционировали независимо друг от друга несколько раз, и разные классы протеаз могут выполнять одну и ту же реакцию с помощью совершенно разных каталитических механизмов.

Иерархия протеаз
На основе каталитического остатка
Протеазы можно разделить на семь широких групп:
Сериновые протеазы - с использованием серинового спирта
Цистеиновые протеазы - с использованием тиола цистеина
Треониновые протеазы - с использованием вторичного спирта треонина
Аспарагиновые протеазы - с использованием аспарагиновой карбоновой кислоты
Глутаминовые протеазы - с использованием глутаматкарбоновой кислоты
Металлопротеазы - с использованием металла, обычно цинка.
Аспарагиновые пептидные лиазы - использование аспарагина для проведения реакции элиминации (не требует воды)
Протеазы были впервые сгруппированы в 84 семейства в соответствии с их эволюционным родством в 1993 году и классифицированы по четырем каталитическим типам: сериновые, цистеиновые, аспарагиновые и металлопротеазы.

Протеазы треонина и протеазы глутаминовой кислоты не были описаны до 1995 и 2004 годов соответственно.
Механизм протеаз, используемый для расщепления пептидной связи, включает превращение аминокислотного остатка, содержащего цистеин и треонин (протеазы) или молекулу воды (аспарагиновая кислота, металло- и кислые протеазы), в нуклеофильные, чтобы он мог атаковать карбонильную группу пептида.
Одним из способов получения нуклеофила является каталитическая триада, в которой остаток гистидина используется для активации серина, цистеина или треонина в качестве нуклеофила.
Однако это не эволюционная группировка, поскольку типы нуклеофилов эволюционировали конвергентно в разные суперсемейства, а некоторые суперсемейства демонстрируют дивергентную эволюцию до нескольких разных нуклеофилов.

Пептидные лиазы
Седьмой каталитический тип протеолитических ферментов, аспарагинпептидлиаза, был описан в 2011 году.
Протеолитический механизм протеаз необычен, так как вместо гидролиза они осуществляют реакцию элиминации.
Во время этой реакции каталитический аспарагин образует циклическую химическую структуру, которая расщепляется по остаткам аспарагина в белках при правильных условиях. Учитывая его принципиально иной механизм, его включение в качестве пептидазы может быть спорным.

Эволюционная филогения
Современная классификация эволюционных суперсемейств протеаз содержится в базе данных MEROPS.
В этой базе данных протеазы сначала классифицируются по «клану» (надсемейству) на основе структуры, механизма и каталитического порядка остатков (например, клан PA, где P обозначает смесь семейств нуклеофилов).
Внутри каждого «клана» протеазы классифицируются по семействам на основе сходства последовательностей.
Каждое семейство может содержать многие сотни родственных протеаз.

В настоящее время известно более 50 кланов, каждый из которых указывает на независимое эволюционное происхождение протеолиза.

Классификация на основе оптимального pH
В качестве альтернативы протеазы можно классифицировать по оптимальному pH, при котором они активны:

Кислотные протеазы
Нейтральные протеазы, участвующие в гиперчувствительности 1 типа.
Здесь он высвобождается тучными клетками и вызывает активацию комплемента и кининов.
К этой группе относятся кальпаины.
Основные протеазы (или щелочные протеазы)
Ферментативная функция и механизм

Роль протеазы
По сравнению с липазой и амилазой, которые расщепляют жиры и углеводы соответственно, семейство протеаз играет более важную роль.
Да, протеаза помогает расщеплять белок в пище на аминокислоты, которые организм затем может использовать для получения энергии, но протеазы выделяются тем, что они также играют ряд других ролей в важных процессах, таких как:
Свертывание крови
Деление клеток
Переработка белков
Иммунная поддержка
В одних случаях ферменты непосредственно ответственны за активацию этих процессов, а в других — ускоряют их до такой степени, что оказывают заметное влияние.
Исследования также показывают, что добавление протеазы может иметь некоторые потенциальные преимущества для здоровья.
Вот некоторые выдающиеся результаты.

Поддержка пищеварения: мы упоминали, что протеаза помогает организму усваивать незаменимые аминокислоты, но, помогая процессу пищеварения, ферменты протеазы могут помочь людям, которые испытывают симптомы расстройства желудка, такие как потеря аппетита, вздутие живота и дискомфорт в животе.

Болезненность мышц: спортсмены считают, что белок является основной частью их режима здоровья, и протеаза также может иметь значение.
В одном исследовании смесь протеазных ферментов уменьшала болезненность и болезненность мышц после тренировки по сравнению с плацебо.

Заживление ран: одно небольшое исследование показало, что отек и ощущение дискомфорта уменьшались у пациентов после стоматологической хирургии после приема фермента протеазы серрапептазы.
Выбор подходящей протеазы
Итак, теперь, когда мы знаем все, на что способны протеазы, откуда их взять?
Как упоминалось ранее, и у растений, и у животных есть протеазы, и в некоторых случаях включение растительных ферментов является отличным вариантом.
Двумя популярными протеазами растительного происхождения являются папаин из папайи и бромелайн из ананасов.
Оба они веками использовались из-за их способности расщеплять белки, но в качестве размягчителя мяса, а не по соображениям здоровья.
Это два самых популярных источника пищи, но есть и другие, такие как имбирь, спаржа, киви и кимчи.
Другой вариант — получать протеазы из добавок для различных функций поддержки здоровья.
Например, использование протеазы в пищеварительной формуле на растительной основе поможет усвоению питательных веществ, поддерживая пищеварительную функцию; Однако протеазы также используются для борьбы с чрезмерной слизью из-за аллергии или перепадов температуры.

Следует отметить, что существует много протеаз, поэтому важно выбрать подходящую протеазу для конкретной задачи.
Когда дело доходит до получения большего количества протеаз с помощью дополнительных средств, важно найти то, что подходит вашему клиенту.
Есть два варианта на выбор, поскольку протеазы доступны в пищеварительных или системных/терапевтических препаратах.
Первые протеазы поступают с пищей, а вторые, в большинстве случаев, выводятся из организма.
Пожалуйста, свяжитесь с вашим представителем Enzyme Science для получения дополнительной информации о доступных вариантах.

Сравнение двух гидролитических механизмов, используемых для протеолиза.
Фермент показан черным цветом, белок-субстрат - красным, а вода - синим.
На верхней панели протеаз показан одностадийный гидролиз, при котором фермент использует кислоту для поляризации воды, которая затем гидролизует субстрат.
Нижняя панель протеаз показывает двухстадийный гидролиз, при котором остаток внутри фермента активируется, чтобы действовать как нуклеофил (Nu) и атаковать субстрат.
Протеазы образуют промежуточное соединение, где фермент ковалентно связан с N-концевой половиной субстрата.
На втором этапе вода активируется для гидролиза этого промежуточного продукта и полного катализа.
Другие остатки фермента (не показаны) отдают и принимают водород и электростатически стабилизируют накопление заряда по механизму реакции.
Смотрите также: Каталитическая триада
Протеазы участвуют в расщеплении длинных белковых цепей на более короткие фрагменты путем расщепления пептидных связей, соединяющих аминокислотные остатки.
Некоторые отщепляют концевые аминокислоты от белковой цепи (экзопептидазы, такие как аминопептидазы, карбоксипептидаза А); другие атакуют внутренние пептидные связи белка (эндопептидазы, такие как трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза).

Катализ
Катализ достигается одним из двух механизмов:

Аспарагиновая, глутаминовая и металлопротеазы активируют молекулу воды, которая осуществляет нуклеофильную атаку на пептидную связь, гидролизуя ее.
Сериновые, треониновые и цистеиновые протеазы используют нуклеофильный остаток (обычно в каталитической триаде).
Остаток протеазы выполняет нуклеофильную атаку, чтобы ковалентно связать протеазу с белком-субстратом, высвобождая первую половину продукта.
Ковалентный промежуточный ацил-фермент протеаз затем гидролизуется активированной водой для завершения катализа путем высвобождения второй половины продукта и регенерации свободного фермента.

Специфика
Протеолиз может быть очень беспорядочным, так что гидролизуется широкий спектр белковых субстратов.
Это относится к пищеварительным ферментам, таким как трипсин, которые должны быть в состоянии расщеплять массив поглощаемых белков на более мелкие пептидные фрагменты. Беспорядочные протеазы обычно связываются с одной аминокислотой на субстрате и поэтому обладают специфичностью только к этому остатку.
Например, трипсин специфичен для последовательностей ...K... или ...R... ("" = сайт расщепления).

И наоборот, некоторые протеазы являются высокоспецифичными и расщепляют субстраты только с определенной последовательностью.
Свертывание крови (например, тромбин) и процессинг вирусных полипротеинов (например, протеаза TEV) требуют такого уровня специфичности для достижения точных событий расщепления.
Это достигается за счет протеаз, имеющих длинную связывающую щель или туннель с несколькими карманами, которые связываются с определенными остатками.
Например, протеаза TEV специфична для последовательности ...ENLYFQS... (''=сайт расщепления).

Деградация и автолиз
Протеазы, сами являясь белками, расщепляются другими молекулами протеаз, иногда той же разновидности.
Это действует как метод регуляции активности протеазы. Некоторые протеазы менее активны после автолиза (например, протеаза TEV), в то время как другие более активны (например, трипсиноген).

Использование
Основная статья: Протеазы (медицинское и родственное применение)
Область исследований протеаз огромна.
С 2004 г. ежегодно публиковалось около 8000 статей, связанных с этой областью.
Протеазы используются в промышленности, медицине и в качестве основного инструмента биологических исследований.

Пищеварительные протеазы входят в состав многих моющих средств для стирки, а также широко используются в хлебопекарной промышленности в качестве улучшителя хлеба.
Различные протеазы используются в медицине как для их нативной функции (например, для контроля свертывания крови), так и для полностью искусственных функций (например, для целенаправленной деградации патогенных белков).
Высокоспецифичные протеазы, такие как протеаза TEV и тромбин, обычно используются для контролируемого расщепления слитых белков и аффинных меток.

Ингибиторы
Основные статьи: Ингибитор протеазы (биология) и Ингибитор протеазы (фармакология)
Протеазная активность протеаз ингибируется ингибиторами протеаз.
Одним из примеров ингибиторов протеазы является суперсемейство серпинов. Он включает альфа-1-антитрипсин (защищающий организм от чрезмерного воздействия собственных воспалительных протеаз), альфа-1-антихимотрипсин (действующий аналогичным образом), С1-ингибитор (защищающий организм от чрезмерной активации собственной системы комплемента, запускаемой протеазами). ), антитромбин (который защищает организм от чрезмерной коагуляции), ингибитор активатора плазминогена-1 (который защищает организм от неадекватной коагуляции, блокируя запускаемый протеазой фибринолиз) и нейросерпин.

Природные ингибиторы протеазы включают семейство липокалиновых белков, которые играют роль в клеточной регуляции и дифференцировке.
Было обнаружено, что липофильные лиганды, присоединенные к липокалиновым белкам, обладают свойствами ингибирования опухолевых протеаз.
Протеазы Натуральные ингибиторы протеазы не следует путать с ингибиторами протеазы, используемыми в антиретровирусной терапии.
Некоторые вирусы, в том числе ВИЧ/СПИД, зависят от протеаз в своем репродуктивном цикле.
Таким образом, ингибиторы протеазы разрабатываются как противовирусные терапевтические средства.

Другие природные ингибиторы протеазы используются в качестве защитных механизмов.
Распространенными примерами являются ингибиторы трипсина, обнаруженные в семенах некоторых растений, наиболее примечательными для человека из которых являются соевые бобы, основная пищевая культура, где они отпугивают хищников.
Сырые соевые бобы токсичны для многих животных, включая человека, до тех пор, пока содержащиеся в них ингибиторы протеазы не будут денатурированы.

Протеазы Использование химических веществ по всему миру в различных отраслях промышленности чрезвычайно возросло, что влияет на здоровье людей.
Протеазы современного мира намерены заменить эти вредные химические вещества экологически чистыми продуктами для улучшения жизни на планете.
Установление ферментативных процессов вопреки химическим процессам было главной задачей ученых.
Различные ферменты, особенно микробные протеазы, наиболее широко используются в различных корпоративных секторах, таких как текстиль, моющие средства, кожа, корма, отходы и другие.
Протеазы в отношении физиологической и коммерческой роли занимают ключевое положение.

Поскольку они выполняют синтетические и разлагающие функции, протеазы встречаются повсеместно, например, в растениях, животных и микробах.
Среди различных продуцентов протеаз Bacillus sp. в основном коммерчески эксплуатируемые микробы для протеаз.
Протеазы успешно считаются альтернативой химическим веществам и экологически безопасным индикатором для природы или окружающей среды.
Эволюционные отношения между кислыми, нейтральными и щелочными протеазами были проанализированы на основе их белковых последовательностей, но по-прежнему не хватает информации, которая регулировала бы разнообразие их специфичности.
Исследователи ищут микробные протеазы, поскольку они могут переносить суровые условия, способы предотвращения аутопротеолитической активности, стабильность при оптимальном pH и субстратную специфичность.
Текущий обзор посвящен сравнению различных протеаз и текущим проблемам, возникающим при производстве и применении на промышленном уровне.
Расшифровка этих вопросов позволила бы нам экономически и коммерчески продвигать микробные протеазы по всему миру.

Введение
Протеазы — это универсальная сущность, которая встречается повсюду, а именно в растениях, животных и микробах.
Пептидная связь, присутствующая в полипептидной цепи аминокислот, гидролизуется с помощью протеаз.
Протеазы являются расщепляющими ферментами и проявляют специфичность и селективность в модификации белков.
В промышленном секторе Bacillus sp. являются наиболее активным и динамичным продуцентом внеклеточной щелочной протеазы.
Одной из трех крупнейших групп промышленных ферментов являются протеазы, и их глобальный рынок ежегодно резко увеличивается.
Из 60% ферментов, продаваемых во всем мире, протеазы составляют 20%.
Протеазы являются неотъемлемым компонентом существующей жизни на Земле, такой как животные, растения и микробы.
В процессе ферментации протеазы могут быть выделены и очищены за относительно короткий период времени, проявляя высокую субстратную специфичность и каталитическую активность.
Протеазы Подсчитано, что протеазы составляют 1–5% генома инфекционных организмов и 2% генома человека.
По мнению исследователей, протеазы контролируют активацию, синтез и оборот белков, чтобы регулировать физиологические процессы.
Различные физиологические процессы, такие как формирование, рождение, старение и даже смерть, регулируются протеазами.
Протеазы жизненно важны для имитации и распространения инфекционных заболеваний, и из-за их важной роли в жизненном цикле они необходимы для открытия лекарств.

В более чем 50 протеазах человека одна аминокислотная мутация может привести к наследственному заболеванию.
Протеазы участвуют в нормальных и патофизиологических процессах или состояниях.
Это участие протеаз может привести к созданию терапевтического средства против смертельных болезней, таких как рак и СПИД.
Близкие по последовательности и структуре протеазы сгруппированы в кланы и семейства, которые имеются в базе данных MEROPS.
Предлагаемый обзор освещает протеолиз, функцию и широкий спектр источников микробных протеаз среди различных бактерий.
В нем также обсуждается широкий спектр приложений и предстоящие успехи в открытии новых и свежих протеаз, особенно щелочных протеаз из бактерий.

Микробные протеазы
Протеазы были успешно получены исследователями из различных микробных источников.
Микробы составляют две трети доли коммерческой протеазы по всему миру.
С момента появления энзимологии микробные протеолитические протеазы были наиболее широко изученным ферментом.
Эти ферменты вызвали интерес не только из-за их жизненно важной роли в метаболической активности, но и из-за их широкого использования в промышленности.
Протеазы Протеазы, доступные на рынке, имеют микробное происхождение из-за их высокой производительности, меньших затрат времени, меньших требований к площади, высоких генетических манипуляций и экономической эффективности, которые сделали их подходящими для биотехнологического применения на рынке.
Протеолитические ферменты, обнаруженные в микробах и системах млекопитающих, имеют небольшой размер, плотную структуру и сферическую форму.
Среди различных продуцентов щелочных протеаз Bacillus sp. имеет огромное значение.

Протеазы, выделенные из этих микробных источников, имеют большое количество разведений в различных отраслях промышленности.
Обычно внеклеточные щелочные протеазы выделяются из продуцента в жидкий бульон, где эти протеазы упрощаются и очищаются путем нисходящего потока для получения конечного продукта.
Для сравнения, протеазы, продуцируемые растениями и животными, более трудоемки, чем протеазы, продуцируемые микробами.
Протеазы, продуцируемые микробными источниками, классифицируют на группы в зависимости от их кислотных или основных свойств.
Их также классифицируют на основе наличия функциональных групп и положения пептидной связи.
Микробные протеазы являются наиболее коммерчески используемыми ферментами во всем мире.
Большое количество внутриклеточных протеаз продуцируется микробами, играющими жизненно важную роль в дифференцировке, обмене белков, регуляции гормонов и пуле клеточных белков, тогда как внеклеточные протеазы играют важную роль в гидролизе белков, например, при обработке фотопленки, ферментативном синтезе на основе приготовления растворителей и детергентов, субстратной специфичности, термоустойчивости и производства гидролизатов зеина.

Кератин
Кератины представляют собой белки, которые обычно присутствуют в двух формах, а именно: твердые кератины и мягкие кератины.
Твердые кератины в основном включают структурные белки, которые преимущественно присутствуют в ногтях, рогах, клювах, верхнем слое кожи и, главным образом, в волосах.
Волокна кератиновых белков самостоятельно собираются в компактные фолликулы, составляющие структуру волос.
Процесс сборки кератиновых белков в сложные волосы находится под контролем множества генов, цитокинов и факторов роста.
В отличие от твердых кератинов, мягкие кератины в изобилии присутствуют в тканях, таких как эпителиальные ткани.
Протеазная структура кератина шерсти имеет большое сходство с кератином волос.
Известны три типа кератина волос.
Первый — это альфа-кератины; их размер варьируется от 60 до 80 кДа.
Имея низкое содержание серы, они состоят в основном из альфа-спиральных доменов.
В целом, альфа-кератины составляют структурный класс белков, поскольку они находятся в коре волокон волос.
Протеазы второго типа – это бета-кератины, которые представляют собой неэкстрагируемый, менее изученный класс кератинов.
Они обычно присутствуют в кутикуле волос и выполняют защитные функции.
Протеазы третьего типа — это гамма-кератины, которые имеют высокое содержание серы; эти кератины имеют размер ~ 15 кДа.
Их размер сравнительно меньше, чем у других классов кератина.
Эти кератины помогают поддерживать кортикальную надстройку, сшивая дисульфидные связи в волосах.
Все эти типы кератинов могут быть расщеплены ферментом кератиназой, который принадлежит к классу ферментов протеаз.
Протеазы, на долю которых приходится 60% продаваемых в мире ферментов, используются во многих областях, таких как моющие средства, продукты питания и обработка кожи.

Фермент кератиназа (EC 3.4.99.11) является одной из групп серингидролазы, которая разрушает дисульфидные водородные связи в белках кератина.
По данным UniProt, одна из протеин-кератиназ, продуцируемых Bacillus subtilis, содержит два домена.
Первый состоит из 59 аминокислот и кодирует ингибитор I9; другой имеет длину 243 аминокислоты и кодирует пептидазу S8.
Первый домен содержит от 19 до 77 аминокислотных последовательностей, а второй домен содержит от 103 до 345 аминокислотных последовательностей.
Фермент также имеет сайт связывания иона металла с ионом кальция.
Это означает, что ионы кальция действуют как кофакторы кератиназ; присутствие ионов кальция в среде может усиливать активность кератиназ.
Структура кератиназы делает ее очень эффективной в деле расщепления кератиновых белков.
Наши ежедневные зеленые отходы и отходы животных содержат большое количество кератинов, которые остаются неразложившимися из-за своей сложности.
Такие нерастворимые кератины могут привести к загрязнению окружающей среды, если их не обрабатывать.
Таким образом, в виде раствора такие отходы обрабатываются ферментами кератиназами, которые превращают отходы в более простые, а также биоразлагаемые вещества.
Внеклеточные кератиназы были успешно выделены из нескольких микробов с использованием нескольких методов ферментации и оптимизации условий, таких как pH, температура, тип источника азота и углерода и выбор микроба.
Кератиназы микробов эффективны, биоразлагаемы, экономичны и дают гораздо лучшие результаты по сравнению с химической обработкой.

Щелочные протеазы
Род Bacillus имеет жизненно важное значение для коммерчески важной щелочной протеазы (EC.3.4.21-24.99), которая активна при щелочном pH в диапазоне от 9 до 11.
Эти щелочные продуценты протеазы распространены в воде, почве и сильно щелочных условиях.
Было установлено выделение щелочных протеаз из различных источников, таких как загрязнение детергентами, сушеная рыба, песчаная почва и скотобойни.
В производстве моющих средств наиболее широко используются щелочные протеазы, представляющие собой сериновые протеазы с щелочным диапазоном рН.
Эти щелочные сериновые протеазы, которые легко инактивируются фенилметансульфонилфторидом (PMSF), составляют треть доли рынка ферментов.
Щелочные протеазы уникальны по своей активности и поддерживают постоянный щелочной pH при использовании для различных составов в фармацевтической, пищевой и других смежных отраслях.

Широкий спектр применения этих щелочных протеаз привлекает все больше внимания исследователей в надежде открыть новые штаммы с уникальными свойствами и существенной активностью.
Сообщается, что для обезвоживания кожи и шкур животных Bacillus sp. обеспечивают желаемые гидролитические, эластолитические и кератинолитические свойства.
Эти штаммы Bacillus используются в коммерческих целях по всему миру из-за огромного количества секретируемого фермента с высокой ферментативной активностью.
Хотя щелочные протеазы производятся из нескольких источников, с растущим спросом на протеазы на рынке и с точки зрения экономической эффективности только те штаммы, которые демонстрируют более высокий выход при гиперактивности, будут приняты в современных биотехнологических достижениях.
Два основных типа щелочных протеаз, такие как субтилизин Carlsberg и субтилизин novo, получают из Bacillus sp. , который можно использовать в качестве промышленного фермента для получения гидролизатов зеина.
В галофильных источниках различные микробные виды. также сообщалось о секретирующих сериновых щелочных протеазах.
Энтомопатогенная бактерия Photorhabdus sp. штамм EK1 (PhPrtPI), содержащий щелочную протеазу Ca2+, классифицируется как металлопротеаза.
Предполагается, что из-за его специфичности широкого спектра действия к различным белкам и пептидам PhPrtPI обеспечивает нематоды питательными веществами путем деградации тканей насекомых.

Salinivibrio sp. штамм AF-2004 продуцирует протеазу металлотипа с приемлемой термостойкостью и широким диапазоном pH (5,0–10,0).
Штамм Proteases настоятельно рекомендуется из-за его термических и галофильных свойств.
Другой штамм, Bacillus clausii, также рекомендуется для использования в промышленных масштабах для производства щелочной протеазы с использованием пептона, меди и фруктозы в качестве единственного источника энергии.
Оптимальные рекомендуемые значения pH и температуры составляют 8–9 и 37–40°C соответственно.
Штамм Bacillus sp., MPTK 712, выделенный из молочной жижи, продуцирующей щелочную протеазу, проявляет симбиотические отношения с морскими корабельными червями.
Очень редкие микробы, такие как Kurthia spiroforme, также способны продуцировать щелочную протеазу.
Некоторые щелочные сериновые протеазы, распознаваемые библиотекой метагеномики козьей кожи, обнаруживают гомологию с пептидазами, а Cryptococcus aureus проявляет хорошую биологическую активность при оптимальной температуре (45–50 °C) и pH (9–10).
Сообщается также о различных грибах, продуцирующих щелочную протеазу.

Кислая протеаза
Кислые протеазы стабильны и активны в диапазоне pH от 3,8 до 5,6 и часто используются в соевом соусе, гидролизате белка, пищеварительных средствах и при производстве приправ.
Оптимальный рН кислых протеаз составляет 3–4, а диапазон изоэлектрической точки составляет от 3 до 4,5 с молекулярной массой 30–45 кДа.
Кроме того, кислые протеазы также используются для очистки пива и фруктовых соков, улучшения текстуры мучной пасты и смягчения мышечных волокон.
По сравнению со щелочными протеазами эти внеклеточные кислые протеазы в основном продуцируются видами грибов, такими как Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus и Aspergillus saitoi.
Большинство грибковых внеклеточных кислых протеаз известны как аспергилловые опепсины. Аспарагиновые протеазы представляют собой кислые протеазы, состоящие из 380–420 длинных цепей аминокислотных остатков, составляющих активный центр каталитической активности.
Кислые протеазы являются эндопептидазами и сгруппированы в три семейства: пепсиновые (А1), ретропепсиновые (А2) и ферменты из пара-ретровирусов (А3).
Эти три семьи помещаются в клан АА.
Установлено, что протеазы A1 и A2 тесно связаны друг с другом, в то время как члены семейства A3 обнаруживают некоторое родство с семействами A1 и A2.
Расщелина активного центра представителей семейства пепсинов расположена между долями двудольного строения.
Большая специфичность кислых протеаз проявляется в отношении остатков ароматических аминокислот, расположенных по обе стороны от пептидной связи. Эти ароматические аминокислотные остатки с пептидными связями подобны пепсину, но действуют менее жестко.
В широком смысле кислые протеазы делятся на две группы: (i) пепсиноподобные ферменты и (ii) ренин-подобные ферменты, продуцируемые Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Endothia и Mucor (Tomoda and Shimazono, 1964).

Нейтральные протеазы
Нейтральные протеазы определяются как активные при нейтральном, слабокислом или слабощелочном рН.
Преимущественно нейтральные протеазы относятся к роду Bacillus и обладают относительно низкой термотолерантностью в диапазоне рН от 5 до 8 (табл. 1).
Они дают меньшую горечь при гидролизе пищевых белков за счет средней скорости реакции; поэтому они считаются более ценными в пищевой промышленности.
Нейтраза используется в пивоваренной промышленности из-за ее нечувствительности к ингибиторам растительных протеиназ.
На основании высокого сродства к гидрофобным аминокислотам идентифицированы и охарактеризованы нейтральные протеазы.
При производстве пищевого гидролизата несколько выгодно контролировать реакционную способность нейтральных протеаз из-за низкой термоустойчивости.
Ион двухвалентного металла необходим для активности нейтральных протеаз, принадлежащих к металлопротеазному типу.

Протеазы также нашли более специализированное применение в процессах очистки небелковых продуктов из животных или растительных экстрактов, включая экстракцию углеводных смол и мукополисахаридов.
Протеазы можно использовать для солюбилизации кератиновых материалов для преобразования отходов, таких как перья, в белковые концентраты для использования в качестве кормов для животных.
Щелочная протеаза из видов Streptomyces также обладает сильной кератинолитической активностью.
Растительные протеазы, папаин и бромелайн, эффективны в качестве ферментов для смягчения мяса, как и нейтральная протеаза B. subtilis.
Другое промышленное применение протеаз включает их использование для извлечения серебра из обычной фотопленки, содержащей желатин, включая рентгеновскую пленку, а также для сжижения промышленных и бытовых органических отходов.
Протеазы также могут потребляться людьми и животными в качестве вспомогательного средства для пищеварения.

Протеазы — это ферменты, разрывающие пептидные связи белков; они делятся на кислые, нейтральные и щелочные протеазы.
Эти ферменты могут быть получены из растений, животных и микроорганизмов в нескольких условиях, таких как высокие концентрации солей.
Галофильные протеазы обладают стабильной активностью при высокой температуре и ионной силой в присутствии органических растворителей.
Некоторые протеазные ферменты имеют потенциальное применение в моющих средствах, фармацевтической промышленности, процессах биоремедиации и пищевой промышленности.

Изучена устойчивость различных протеаз к органическому растворителю, например устойчивость протеазы штамма M9 Halobacillus blutaparonensis к эфиру, изооктану и циклогексану; и толерантность к Geomicrobium sp.
EMB2 в этанол, бензол, циклогексан и гептан.
В пищевой промышленности протеазы играют роль в процессах ферментации для получения соединений со специфическими характеристиками вкуса и аромата.
Протеазы также использовались при приготовлении рыбного соуса, при предварительной обработке кожи в кожевенной промышленности и в рецептуре лечебных диетических продуктов.

Протеолитические ферменты (протеазы) — ферменты, расщепляющие белок.
Эти ферменты производятся животными, растениями, грибами и бактериями.

Протеолитические ферменты расщепляют белки в организме или на коже.
Это может помочь пищеварению или расщеплению белков, вызывающих отек и боль.
Некоторые протеолитические ферменты, которые можно найти в добавках, включают бромелайн, химотрипсин, фицин, папаин, серрапептазу и трипсин.

Протеолитические ферменты используются для лечения длинного списка состояний, включая очистку ран на коже, помощь пищеварению, боли и отеки и многие другие состояния.
Обратитесь к конкретным темам для получения дополнительной информации об использовании и эффектах.

протеолитический фермент, также называемый протеазой, протеиназой или пептидазой, любой из группы ферментов, которые расщепляют длинноцепочечные белковые молекулы на более короткие фрагменты (пептиды) и, в конечном итоге, на их компоненты, аминокислоты.
Протеолитические ферменты имеются у бактерий, архей, некоторых видов водорослей, некоторых вирусов и растений; однако они наиболее многочисленны у животных.

Существуют различные типы протеолитических ферментов, которые классифицируются в соответствии с сайтами, в которых они катализируют расщепление белков.
Двумя основными группами являются экзопептидазы, которые нацелены на концевые концы белков, и эндопептидазы, которые нацелены на участки внутри белков.
Эндопептидазы используют различные каталитические механизмы; в эту группу входят аспарагиновые эндопептидазы, цистеиновые эндопептидазы, глутаминовые эндопептидазы, металлоэндопептидазы, сериновые эндопептидазы и треониновые эндопептидазы.
Термин олигопептидаза зарезервирован для тех ферментов, которые действуют специфически на пептиды.

Среди наиболее известных протеолитических ферментов те, которые находятся в пищеварительном тракте.
В желудке белковые материалы первоначально атакуются желудочной эндопептидазой, известной как пепсин.
Когда белковый материал попадает в тонкую кишку, белки, которые лишь частично перевариваются в желудке, подвергаются дальнейшей атаке протеолитическими ферментами, секретируемыми поджелудочной железой.
Эти ферменты высвобождаются в тонком кишечнике из неактивных предшественников, продуцируемых ацинарными клетками поджелудочной железы.
Предшественники называются трипсиноген, химотрипсиноген, проэластаза и прокарбоксипептидаза.
Трипсиноген трансформируется в эндопептидазу, называемую трипсином, под действием фермента (энтерокиназы), секретируемого стенками тонкой кишки.
Затем трипсин активирует предшественники химотрипсина, эластазу и карбоксипептидазу. Когда ферменты поджелудочной железы активируются в кишечнике, они превращают белки в свободные аминокислоты, которые легко усваиваются клетками кишечной стенки.
Поджелудочная железа также вырабатывает белок, называемый панкреатическим секреторным ингибитором трипсина, который связывается с трипсином и блокирует его активность.
Считается, что таким образом поджелудочная железа защищает себя от самопереваривания.

Вероятно, протеазы возникли на самых ранних стадиях эволюции белков как простые деструктивные ферменты, необходимые для катаболизма белков и образования аминокислот в примитивных организмах. В течение многих лет исследования протеаз были сосредоточены на их первоначальной роли тупых агрессоров, связанных с разрушением белков. Однако осознание того, что помимо этих неспецифических деструктивных функций, протеазы действуют как острые ножницы и катализируют высокоспецифические реакции протеолитического процессинга с образованием новых белковых продуктов, открыло новую эру в исследованиях протеаз.
Нынешний успех исследований этой группы древних ферментов обусловлен, главным образом, большой коллекцией результатов, демонстрирующих их значимость для контроля множества биологических процессов во всех живых организмах.

Таким образом, протеазы регулируют судьбу, локализацию и активность многих белков, модулируют белок-белковые взаимодействия, создают новые биологически активные молекулы, участвуют в обработке клеточной информации и генерируют, преобразовывают и усиливают молекулярные сигналы.
В результате этих множественных действий протеазы влияют на репликацию и транскрипцию ДНК, пролиферацию и дифференцировку клеток, морфогенез и ремоделирование тканей, тепловой шок и ответы развернутых белков, ангиогенез, нейрогенез, овуляцию, оплодотворение, заживление ран, мобилизацию стволовых клеток, гемостаз и т. свертывание крови, воспаление, иммунитет, аутофагия, старение, некроз и апоптоз.
В соответствии с этой важной ролью протеаз в поведении клеток, выживании и смерти всех организмов изменения в протеолитических системах лежат в основе множества патологических состояний, таких как рак, нейродегенеративные расстройства, воспалительные и сердечно-сосудистые заболевания.

Соответственно, многие протеазы находятся в центре внимания фармацевтической промышленности как потенциальные мишени для лекарств или как диагностические и прогностические биомаркеры.
Протеазы также играют ключевую роль в растениях и способствуют процессингу, созреванию или разрушению специфических наборов белков в ответ на сигналы развития или изменения условий окружающей среды.
Точно так же многие инфекционные микроорганизмы нуждаются в протеазах для репликации или используют протеазы в качестве факторов вирулентности, что способствовало разработке направленных на протеазы методов лечения заболеваний, имеющих большое значение для жизни человека, таких как СПИД.
Наконец, протеазы также являются важными инструментами биотехнологической промышленности из-за их полезности в качестве биохимических реагентов или при производстве многочисленных продуктов.

Это выдающееся разнообразие функций протеаз напрямую связано с эволюционным изобретением множества ферментов, которые демонстрируют различные размеры и формы.
Таким образом, архитектурный дизайн протеаз варьируется от небольших ферментов, состоящих из простых каталитических единиц ( ∼ 20 кДа), до сложных машин для процессинга и деградации белков, таких как изоформы протеасом и меприн-металлопротеиназ (0,7–6 МДа) (15).
С точки зрения специфичности разнообразие также является общим правилом.
Таким образом, некоторые протеазы проявляют исключительную специфичность в отношении уникальной пептидной связи одного белка; однако большинство протеаз относительно неспецифичны в отношении субстратов, а некоторые явно беспорядочны и нацеливаются на несколько субстратов неизбирательным образом.
Протеазы также следуют различным стратегиям, чтобы установить свое соответствующее положение в клеточной географии, и в большинстве случаев действуют в контексте сложных сетей, включающих различные протеазы, субстраты, кофакторы, ингибиторы, адаптеры, рецепторы и связывающие белки, которые обеспечивают дополнительный уровень интерес, но и сложность в изучении протеолитических ферментов.

Эта работа призвана служить учебником для серии мини-обзоров по протеазам, которые будут опубликованы в следующих выпусках этого журнала.
Эта вступительная статья будет посвящена обсуждению большой и растущей сложности протеолитических ферментов, присутствующих во всех организмах, от бактерий до человека.
Сначала мы приведем результаты сравнительного геномного анализа, проливающие свет на реальные размеры протеолитического пространства.
Затем будут рассмотрены уровни сложности протеаз и механизмы регуляции протеаз. Наконец, мы обсудим текущие границы и будущие перспективы в исследованиях протеаз.

Идти к:
Огромный протеолитический ландшафт
Протеазы являются эффективными исполнителями обычной химической реакции: гидролиза пептидных связей.
Большинство протеолитических ферментов расщепляют α-пептидные связи между встречающимися в природе аминокислотами, но есть некоторые протеазы, которые выполняют несколько иные реакции.
Таким образом, большая группа ферментов, известных как DUB (деубиквитилирующие ферменты), может гидролизовать изопептидные связи в конъюгатах убиквитина и убиквитин-подобных белков; γ-глутамилгидролаза и глутаматкарбоксипептидаза нацелены на γ-глутамиловые связи; γ-глутамилтрансферазы как переносят, так и расщепляют пептидные связи; а внутримолекулярные аутопротеазы (такие как нуклеопорин и полицистин-1) гидролизуют только одну связь в собственной полипептидной цепи, но затем теряют свою протеолитическую активность.
Примечательно, что при некоторых условиях протеазы также могут синтезировать пептидные связи.

Первоначально протеазы были классифицированы на эндопептидазы, которые нацелены на внутренние пептидные связи, и экзопептидазы (аминопептидазы и карбоксипептидазы), действие которых направляется NH2- и СООН-концами их соответствующих субстратов.
Однако наличие структурной и механистической информации об этих ферментах способствовало созданию новых схем классификации.
На основании механизма катализа протеазы подразделяются на шесть различных классов: аспарагиновые, глутаминовые и металлопротеазы, цистеиновые, сериновые и треониновые протеазы, хотя глутаминовые протеазы до сих пор не обнаружены у млекопитающих.

Первые три класса используют молекулу активированной воды в качестве нуклеофила для атаки на пептидную связь субстрата, тогда как в остальных ферментах нуклеофил представляет собой аминокислотный остаток (Cys, Ser или Thr соответственно), расположенный в активном центре от из которых вытекают имена классов.
Протеазы различных классов могут быть дополнительно сгруппированы в семейства на основе сравнения аминокислотных последовательностей, а семейства могут быть объединены в кланы на основе сходства их трехмерных структур.
Биоинформатический анализ геномных последовательностей имел решающее значение для установления размеров сложности протеолитических систем, действующих в различных организмах.
Последний выпуск MEROPS (merops.sanger.ac.uk), обширной базы данных протеаз и ингибиторов, содержит аннотации 1008 записей для человеческих протеаз и гомологов, хотя он включает большое количество псевдогенов и связанных с протеазами последовательностей, полученных из эндогенных ретровирусных клеток. элементы, встроенные в наш геном.
В тщательно отобранной базе данных Degradome Database, которая не включает псевдогены протеаз или эти последовательности, полученные из ретровирусов, перечислены 569 человеческих протеаз и гомологов, классифицированных в 68 семейств.
Металлопротеазы и сериновые протеазы являются наиболее густонаселенными классами, насчитывающими 194 и 176 членов соответственно, за которыми следуют 150 цистеиновых протеаз, тогда как треониновые и аспарагиновые протеазы содержат только 28 и 21 член соответственно.

Протеолитический гидролиз пептидных связей признан важным и вездесущим механизмом регуляции множества физиологических процессов.
Четыре основных класса протеолитических ферментов обычно используются для описания протеаз.
Сериновые протеазы, вероятно, охарактеризованы лучше всего.
Этот класс протеаз включает трипсин, химотрипсин и эластазу.
Класс цистеиновых протеаз включает папаин, кальпаин и лизосомальные катепсины.
Аспарагиновые протеазы включают пепсин и реннин.
Металлопротеазы включают термолизин и карбоксипептидазу А.
Ознакомьтесь с нашим комплексным предложением тщательно протестированных протеиназ для нужд вашего рабочего процесса с белками.

ПРОТЕАЗЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ПРИМЕНЕНИЙ
Наш поиск протеаз поможет исследователям найти эндо- и экзопептидазы, необходимые для точного расщепления белка.
Способствуя каталитическому расщеплению белков на более мелкие полипептиды или отдельные аминокислоты, наши протеазы обеспечивают широкий спектр предложений для удовлетворения ваших потребностей в исследованиях белков.

ПРОТЕАЗЫ ДЛЯ ПРОТЕОМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Протеазы обычно используются в исследованиях протеомики и подходят для расщепления белков на небольшие пептидные фрагменты для масс-спектрометрического анализа с последующим секвенированием (тандемная МС).
Трипсин образует пептиды в полезном для масс-спектрометрии диапазоне масс и признан наиболее часто используемой протеазой для идентификации белков.
Изучите наши стабильные в растворе рекомбинантные продукты SOLu-трипсин (EMS0004) (EMS0005) для получения дополнительной информации.
Кроме того, бывают случаи, когда отдельное или последовательное расщепление другими протеазами может быть лучшим выбором для интересующего вас белка.
Мы предлагаем различные протеазы для секвенирования, подходящие для использования при подготовке проб для масс-спектрометрии.

ПРОТЕАЗЫ ДЛЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ И ПРИКЛАДНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Протеазы имеют коммерческое значение в различных промышленных и прикладных секторах и имеют множество применений.
Благодаря большому разнообразию физиологических характеристик, включая гидролиз при экстремальных значениях pH или повышенных температурах, они идеально подходят для использования в фармацевтической, диагностической, текстильной, пищевой и пищевой промышленности.
Конкретные области применения этих протеаз включают, но не ограничиваются ими; тестирование пищевых волокон и добавки для очистки на месте для удаления загрязнений.
У нас есть широкий ассортимент очищенных ферментов и смесей ферментов для исследований и разработки новых процессов, продуктов и анализов.

НАБОРЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРОТЕАЗЫ
Мы предлагаем два простых в использовании набора для обнаружения следовых количеств протеазы или для определения общей активности протеазы с использованием тех же методологий, которые годами используются нашим отделом контроля качества.
Мы использовали эти протоколы для проверки тысяч образцов на протеолитическую активность.

Наборы для обнаружения протеаз представляют собой полные наборы для обнаружения первичной или следовой активности протеаз путем флуорометрического или колориметрического обнаружения по вашему выбору. Все, что вам нужно, включая контроль, стандарты, буферы и субстрат, включено.
Для удобства анализ можно проводить в формате кюветы или микропланшета.
Каждый набор содержит достаточное количество реагентов для 200 анализов по 1 мл.
Для большей чувствительности при измерении низких уровней активности протеазы рекомендуется использовать набор для флуоресцентного обнаружения протеаз (PF0100). Для более точного количественного определения активности первичной протеазы рекомендуется использовать набор для колориметрического обнаружения протеаз (PC0100).

Как набор для флуорометрического обнаружения, так и набор для колориметрического обнаружения были протестированы на репрезентативных образцах всех четырех типов классов протеаз (сериновых, аспарагиновых, цистеиновых и металлопротеаз) для обеспечения широкого применения.

Протеазы - это ферменты, которые гидролизуют другие белки, включая другие протеазы, что ставит под сомнение предположения об инертности ферментов в химических реакциях и изменяет предсказанные концентрации протеаз-субстратов с использованием установленных структур действия масс.
Цистеиновые катепсины являются мощными протеазами, участвующими во многих заболеваниях путем расщепления субстратов, но они также гидролизуют друг друга, что требует включения еще не определенной динамики протеаз как субстратов.
Здесь мы использовали экспериментальные и вычислительные модели для улучшения прогнозов концентраций нескольких видов и промежуточных продуктов, образующихся во время деградации субстрата в мультипротеазных системах, путем включения реакций самопереваривания, инактивации, каннибализма и отвлечения протеазы на протеазу в протеолитических сетях.
Это было доступно в Интернете для других, чтобы проверить возмущения и предсказать сдвиги в протеолитических сетевых реакциях и системной динамике.

Абстрактный
Ферменты — это катализаторы биохимических реакций, которые, по определению, увеличивают скорость реакций, не изменяясь и не разрушаясь.
Однако, когда этот фермент является протеазой, подклассом ферментов, которые гидролизуют другие белки, и эта протеаза находится в мультипротеазной системе, должна быть включена динамика протеазы как субстрата, что ставит под сомнение предположения об инертности фермента, сдвигая кинетические предсказания этой системы.
Гидролиз, инактивирующий протеазу на протеазе, может изменить прогнозируемые концентрации протеазы, используемые для определения стратегий дозирования фармацевтических препаратов.

Цистеиновые катепсины представляют собой протеазы, способные к катепсиновому каннибализму, когда один катепсин гидролизует другой в присутствии субстрата, и неправильное понимание этой динамики может привести к ошибочным расчетам нескольких протеаз, работающих в одной протеолитической сети взаимодействий, происходящих в определенном компартменте.
Как только определены скорости связывания и катализа отдельных протеаз на протеазе, можно исследовать динамику протеолитической сети с использованием вычислительных моделей совместной/конкурентной деградации несколькими протеазами в одной системе при одновременном включении расщепления субстрата.
В ходе оптимизации параметров было выявлено, что происходят дополнительные реакции отвлечения, при которых инактивированные протеазы становятся конкурентными ингибиторами оставшихся активных протеаз, вводя еще один узел сетевой реакции.
В совокупности улучшенные прогнозы деградации субстрата в множественной протеазной сети были достигнуты после включения условий реакции самопереваривания, инактивации, каннибализма и отвлечения, изменяя кинетические соображения других ферментативных систем, поскольку фермент может быть потерян в результате протеолитической деградации.

Протеазы, также называемые пептидазами или протеиназами, представляют собой ферменты, осуществляющие протеолиз. Протеолиз — одна из важнейших биологических реакций. Протеолитическую активность приписывают классу ферментов, называемых протеазами.
Эти ферменты имеют широкое распространение и выполняют важные биологические процессы.
Протеазы эволюционировали, чтобы выполнять эти реакции с помощью множества различных механизмов, и разные классы протеаз могут выполнять одну и ту же реакцию с помощью совершенно разных каталитических механизмов.
Протеазы обнаружены у животных, растений, бактерий, архей и вирусов.
Протеазы участвуют в процессинге белков, регуляции функции белков, апоптозе, вирусном патогенезе, пищеварении, фотосинтезе и многих других жизненно важных процессах.
Механизм действия протеаз классифицирует их либо как сериновые, цистеиновые или треониновые протеазы (амино-концевые нуклеофильные гидролазы), либо как аспарагиновые, металло- и глутаминовые протеазы (при этом глутаминовые протеазы являются единственным подтипом, не обнаруженным до сих пор у млекопитающих).

Каковы функции протеаз?
Протеазы участвуют во многих аспектах биологии человека.
Например, в тонком кишечнике протеазы переваривают пищевые белки, обеспечивая всасывание аминокислот.
Другие процессы, опосредованные протеазами, включают свертывание крови, иммунную функцию, созревание прогормонов, формирование костей, запрограммированную гибель клеток и рециркуляцию клеточных белков, которые больше не нужны.

Протеазы, классифицированные по каталитическим доменам
Протеазы можно разделить на семь широких групп:

Сериновые протеазы
Используя сериновый спирт, проявляют широкий спектр функций.

Цистеиновые протеазы
Использование тиола цистеина, включая каспазы, участвующие в апоптозе и воспалении, и катепсины, способствующие деградации белка.

Треониновые протеазы
Использование вторичного спирта треонина

Глутаминовые протеазы
Использование глутаматкарбоновой кислоты

Металлопротеазы
Использование металла, обычно цинка.
Семейство металлопротеаз включает аминопептидазы и эндопептидазы, которые являются секретируемыми, мембраносвязанными или цитозольными.

Аспарагиновые пептидные лиазы
Использование аспарагина для проведения реакции элиминации (не требует воды)
 
Протеазы традиционно рассматривались как простые ферменты, расщепляющие белки, с очень ограниченным спектром субстратов.
Большое расширение исследований протеаз открыло множество новых субстратов, и теперь очевидно, что протеазы являются критическими плейотропными действующими лицами, управляющими патофизиологическими процессами.
Недавние открытия показали, что чистая протеолитическая активность также зависит от взаимосвязей между различными семействами протеаз и ингибиторов протеаз в протеазной сети.

В этом обзоре мы представляем обзор этих новых концепций с особым акцентом на легочную патофизиологию.
Мы описываем новые роли нескольких семейств протеаз, включая цистеиновые и сериновые протеазы.

Сложность протеазной сети иллюстрируется в свете многомерной регуляции активности сериновых протеаз матриксными металлопротеазами посредством процессинга родственным ингибитором сериновых протеаз.
Наконец, мы подчеркнем, как нерегулируемая активность протеазы во время легочного патогенеза может быть использована для целей диагностики/прогноза и использована в качестве терапевтического инструмента с использованием нанотехнологий.

Рассмотрение протеаз как части интегративной биологии может проложить путь к разработке новых терапевтических мишеней для лечения легочных заболеваний, связанных с внутренней дерегуляцией протеаз.

Протеазы и другие ферменты
Протеаза — это общий термин для класса ферментов, которые гидролизуют пептидные связи белков.
По способу гидролиза полипептида его можно разделить на два типа: эндопептидазу и экзопептидазу.
Эндопептидаза расщепляет внутреннюю часть белковой молекулы с образованием небольшого молекулярного пептида.
Экзопептидаза гидролизует пептидную связь одну за другой с конца свободной аминогруппы или карбоксильной группы белковой молекулы, и аминокислота высвобождается, причем первая представляет собой аминопептидазу, а вторая - карбоксипептидазу.
Протеазу можно дополнительно разделить на сериновую протеазу, тиоловую протеазу, металлопротеиназу и аспарагиновую протеазу в соответствии с ее активным центром.

В соответствии с оптимальным значением рН реакции она делится на кислую протеазу, нейтральную протеазу и щелочную протеазу.
В промышленном производстве используются протеазы, в основном эндопептидазы.
Протеазы широко распространены во внутренних органах животных, стеблях растений, листьях, плодах и микроорганизмах.
Микробные протеазы в основном продуцируются плесенью и бактериями, за которыми следуют дрожжи и актиномицеты.
Протеазы имеют много типов, и важными из них являются пепсин, трипсин, катепсин, папаин и субтилизин.
Протеаза обладает строгой селективностью в отношении применяемого реакционного субстрата.
Протеазы могут действовать только на определенные пептидные связи в белковых молекулах, такие как пептидные связи, образованные катализируемым трипсином гидролизом основных аминокислот.
Протеаза является широко распространенным белком, и ее особенно много в пищеварительном тракте человека и животных.
Из-за ограниченных ресурсов животных и растений промышленное производство препаратов протеаз в основном получают путем ферментации таких микроорганизмов, как Bacillus subtilis и Aspergillus oryzae.

Другие ферменты
Фермент представляет собой белок или РНК, продуцируемый живыми клетками, обладающий высокой специфичностью и высокой каталитической активностью по отношению к своему субстрату.
Ферменты представляют собой очень важный класс биокатализаторов.
По характеру реакции, катализируемой ферментом, ферменты делятся на шесть категорий.

Оксидоредуктаза представляет собой фермент, который способствует окислительно-восстановительной реакции субстрата.
Протеазы представляют собой ферменты, катализирующие окислительно-восстановительную реакцию, и их можно разделить на два типа: оксидазы и редуктазы.
Трансферазы представляют собой ферменты, катализирующие перенос или обмен определенных групп (таких как ацетильные, метильные, амино, фосфатные и др.) между субстратами, включая метилтрансферазу, аминотрансферазу, ацетилтрансферазу, киназу и полимеразу и т.д.
Ферменты-гидролазы катализируют гидролиз субстратов, такие как амилаза, протеаза, липаза, фосфатаза, гликозидаза и им подобные.
Лиазы удаляют группу из субстрата (не гидролизуются) и оставляют двойную связь или ее обратную реакцию, включая дегидратазу, декарбоксилазу, карбоангидразу, альдолазу, цитратсинтазу и тому подобное.
Многие лиазы катализируют обратную реакцию, которая создает новую химическую связь между двумя субстратами и устраняет двойную связь субстрата, и синтаза принадлежит к этому классу.

Изомераза преобразует свои субстраты между различными изомерами, геометрическими изомерами или оптическими изомерами.
Лигаза катализирует синтез двухмолекулярного субстрата в единую молекулу соединения в сочетании с АТФ-связанным ферментом, расщепляющим фосфат, таким как глутаминсинтетаза, ДНК-лигаза, биотин-зависимая карбоксилаза и т.п.
В соответствии с принципом единообразной классификации ферментов, опубликованным Международной биохимической ассоциацией, на основе шести вышеуказанных категорий и каждого из основных типов ферментов, а также характеристик групп или связей, действующих на субстрат, делится на несколько подкатегорий.
Точно указывая на природу субстрата или реагента, каждый подкласс подразделяется на несколько групп (подподклассов); каждая группа содержит сразу несколько ферментов.
Благодаря характеру фермента, химическая реакция в живом организме может осуществляться эффективно и конкретно в чрезвычайно мягких условиях.

Протеазы представляют собой класс ферментов, осуществляющих протеолиз, механизм переваривания или расщепления длинноцепочечных белков на более мелкие фрагменты путем разрыва пептидных связей, удерживающих их вместе.
Трипсин, сериновая протеаза, секретируемая поджелудочной железой, обычно используется в культурах клеточных тканей для расщепления связей, которые клетки используют для прикрепления к колбе.

Протеазы также играют важную роль в заболевании. Протеаза ВИЧ-1 необходима для процесса репликации вируса. ММР-9, матриксная металлопептидаза, играет роль в ангиогенезе и является терапевтической мишенью для рака.
Протеазы играют важную роль во многих сигнальных путях, поэтому может быть трудно достичь селективности при нацеливании на активные сайты протеаз.

Широкий портфель Eurofins Discovery, включающий более 50 протеаз-мишеней, охватывает семейства сериновых, цистеиновых, аспарагиновых и металлопротеаз и обеспечивает основу для наших услуг по скринингу и профилированию.
Ключевые семейства протеаз и мишени, включенные в наши услуги, выделены ниже.

Протеазы классифицируются по аминокислотам или лигандам, которые катализируют реакцию гидролиза.
Например, сериновые протеазы содержат серин в активном центре.
Серину помогают соседние гистидин и аспарагиновая кислота.
Эта комбинация называется каталитической триадой и сохраняется во всех сериновых протеазах.
Сериновые протеазы работают в два этапа; во-первых, они образуют ковалентную связь с расщепляемым белком; на втором этапе поступает вода и высвобождает вторую половину расщепленного белка.
Цистеиновые протеазы используют цистеин в качестве нуклеофила точно так же, как сериновые протеазы используют серин в качестве нуклеофила.

Сериновые протеазы включают ряд пищеварительных ферментов, включая трипсин, химотрипсин и эластазу.
Хотя все они содержат одни и те же три аминокислоты, которые вместе катализируют реакцию, называемую каталитической триадой, они различаются тем, где они расщепляют белки.

Эта специфичность обусловлена связывающим карманом, который содержит различные функциональные группы.
Химотрипсин предпочитает большой гидрофобный остаток; его карман большой и содержит гидрофобные остатки.
На этом изображении кармана связывания гидрофобный фенилаланин субстрата показан зеленым цветом, а гидрофобность окружающих аминокислот показана серыми (гидрофобными) или пурпурными (гидрофильными) шариками.
Трипсин специфичен для положительно заряженных остатков, таких как лизин, и содержит отрицательную аминокислоту, аспарагиновую кислоту, на дне кармана.
Эластаза предпочитает небольшой нейтральный остаток; у него очень маленький карман.

Цистеиновые протеазы включают ферменты, которые играют роль в регуляции клеточных процессов, такие как каспазы и деубиквитиназы.

Другой класс протеаз - аспартатные протеазы.
Это семейство включает протеазу ВИЧ. ВИЧ производит свои белки как одну длинную цепь; Протеаза ВИЧ расщепляет длинный белок на функциональные единицы.
Поскольку он расщепляет длинные белки, он имеет туннель для размещения длинного пептидного субстрата, а верхние «створки» белка могут открываться и закрываться, позволяя субстрату входить и выходить продуктам.
Аспартатные протеазы включают в себя два остатка аспартата в активном центре, которые увеличивают реактивность молекулы воды в активном центре для непосредственного расщепления белка-субстрата.

Третьим классом протеаз являются металлопротеазы, такие как карбоксипептидаза.
Карбоксипептидазы удаляют С-концевые аминокислоты из белков.
Активный центр содержит цинк, который связывается с белком посредством взаимодействия с остатками гистидина (Н), серина (S) и аспарагиновой кислоты (Е).

Виртуальная встреча по сериновым протеазам в перицеллюлярном протеолизе и передаче сигналов продолжает традицию специального симпозиума ASBMB по заякоренным в мембране сериновым протеазам с расширенным вниманием к другим родственным протеазам с перекрывающимися субстратами и функциями в околоклеточной среде.

Конференция традиционно объединяет ведущих национальных и зарубежных исследователей в области перицеллюлярного протеолиза и предоставляет им форум для представления своих последних результатов, обмена идеями и технологиями, а также налаживания связей для сотрудничества.
Что не менее важно, он также предоставляет младшим исследователям на уровне аспирантов и докторантов возможность обсудить свои текущие исследования, встретиться с экспертами в этой области и наладить новые научные взаимодействия, имеющие решающее значение для их будущего карьерного роста.
С этой целью мы планируем интерактивную постерную сессию и легкий доступ к видеозаписям докладчиков, чтобы повысить наглядность их работы.
Проведение встречи в виртуальном формате дает уникальную возможность сделать эту конференцию еще более доступной для студентов, а также для исследователей из других областей, связанных с перицеллюлярным протеолизом.

Темы охватывали
Расщепление белков внеклеточной среды, включая гормоны, факторы роста и их рецепторы, ионные каналы, молекулы клеточной адгезии и структурные компоненты внеклеточного матрикса, играет ключевую роль в регуляции поведения клеток.
Среди более чем 500 протеолитических ферментов, кодируемых геномами млекопитающих, заякоренные в мембране сериновые протеазы, которые экспрессируются на клеточной поверхности во всех основных органах, превосходно подходят для опосредования передачи сигнала через плазматическую мембрану и все чаще признаются в качестве важных регуляторов органов. развития и гомеостаза.
В то же время показано, что безудержный перицеллюлярный протеолиз способствует дисфункции эпителиального и эндотелиального барьеров, воспалительным, сердечно-сосудистым и респираторным заболеваниям, а также раку.
В настоящее время известно, что многие вирусы типа гриппа и коронавируса, включая SARS-CoV-2, также используют активность этих протеаз для проникновения в клетку-мишень, что делает MASP основным фактором, определяющим восприимчивость клеток к инфекции.

Помимо роли сериновых протеаз в вирусной биологии, на встрече будут рассмотрены такие темы, как биосинтез, транспортировка и посттрансляционные модификации, эндогенные и фармакологические ингибиторы, эволюционные и другие физиологические функции, механизмы нарушения регуляции и патологические последствия, а также молекулярные механизмы протеаз. -опосредованная сигнализация.

Протеазы – ферменты, специализирующиеся на расщеплении пептидных связей.
Их действия могут быть относительно неизбирательными, расщепляющими полипептиды до их основных элементов, или исключительно точными, расщепляющими субстрат по определенному остатку для изменения активности белка.
Эти иллюстрации освещают научные концепции, основанные на протеолитической активности, и подчеркивают важность протеаз в некоторых наиболее изученных областях клеточной биологии.

Ферменты — это необходимые для жизни биокатализаторы, которые катализируют почти все биологические процессы.
С древних времен ферменты использовались при производстве различных пищевых продуктов, включая пиво, вино, уксус, сыр и закваску, а также при производстве таких товаров, как кожа, лен и индиго.
Биокатализ превратился в необходимый инструмент в промышленном производстве активных фармацевтических препаратов, агрохимических и фармацевтических промежуточных продуктов, сыпучих химикатов и пищевых ингредиентов.
Хотя ферменты изначально не использовались в чистом виде, процессы ферментации, производящие чистые ферменты из определенного штамма, в конечном итоге были разработаны в больших масштабах.
Микроорганизмы внесли существенный вклад в промышленную биологию.
Микробные ферменты играют важную роль в качестве метаболических катализаторов и, следовательно, используются в различных промышленных целях.
В настоящее время большинство ферментов, используемых в промышленных процессах, являются гидролитическими и используются для разложения различных природных веществ.

Протеаза остается доминирующим типом фермента из-за ее широкого применения в молочной промышленности и производстве моющих средств.
Протеазы являются очень важными ферментами, на их долю приходится более 60% от общего объема мировых продаж ферментов.
Эти ферменты можно разделить на две основные группы: эндопептидазы, расщепляющие внутренние пептидные связи, и экзопептидазы, расщепляющие С- или N-концевые пептидные связи.
Фермент протеаза катализирует гидролитическую реакцию, которая приводит к расщеплению белковых молекул на аминокислоты и пептиды.
Микробы служат лучшим источником протеаз, чем растения и животные, потому что их можно культивировать в больших количествах за короткое время, они относительно недороги и могут непрерывно производить желаемый продукт.

Есть три хорошо известных фермента, которые проходят через механизм действия сериновой протеазы, это: химотрипсин, трипсин и эластаза.
Мы подробно рассмотрим ферментативный механизм химотрипсина.

Протеаза — это фермент, гидролизующий пептидные связи, соединяющие аминокислоты в белке. Протеазы специфичны для определенных аминокислот и могут гидролизовать эти аминокислоты на карбокси- или амино-стороне пептидной связи.

Существует два основных типа протеаз:
Эндопротеазы (сериновые протеазы):
Может расщеплять специфические пептидные связи в белке.

Экзопротеазы:
Отщепляют только концевые аминокислотные остатки.
Проферменты (зимогены):
Фермент, первоначально синтезированный в неактивной форме, но присутствующий и готовый действовать быстро, когда это необходимо.
Сериновые протеазы являются хорошими примерами проферментов или зимогенов.

Физиологические роли проферментов, таких как сериновые протеазы:
1) Переваривание белков в тонком кишечнике.
т.е. Трипсиноген (профермент) ---------> Трипсин (активная форма)
2) Свертывание крови

Химотрипсин:
>Используется в качестве примера сериновой протеазы, поскольку ее структура и механизм хорошо изучены.
> Катализирует гидролиз пептидных связей на карбоксильной стороне объемных ароматических боковых цепей (Tyr, Phe, Trp).

Активный сайт:
1) Серин, с которым связывается субстрат, все активные центры сериновых протеаз содержат серин.
2) Гистидин, способность отдавать и принимать протоны.
3) Аспартат, способность принимать протоны, конечное звено, необходимое для действия химотрипсина.

Примечания:
>Эти остатки являются полярными (гидрофильными), поэтому обычно их нельзя обнаружить «внутри» белка, и они обычно депротонируются при физиологическом pH, за исключением их критической роли в катализе.
>Хотя они находятся в непосредственной близости в структуре 30, они не являются соседними в первичной последовательности

Что такое протеаза?
Белки представляют собой цепочки отдельных аминокислот, которые связаны ковалентными связями, называемыми пептидными связями, в процессе трансляции белка.
В клетке постоянно транслируются новые белки, а старые расщепляются, чтобы обеспечить точные концентрации функционального белка, необходимого для выполнения различных клеточных процессов.
Процесс деградации белков, называемый протеолизом, расщепляет белки обратно на отдельные аминокислоты. Протеолиз осуществляется протеазами, группой ферментов, механизмы которых зависят от конкретного класса протеаз.

Активность протеаз строго регулируется в клетке, и эта регуляция осуществляется с помощью различных механизмов.
Одним из примеров регулируемой активации протеазы является инициация апоптоза или запрограммированной гибели клеток.
Активация каспазы и последующее расщепление нижестоящих белков играют важную роль в апоптозе.
Большинство клеточных каспаз существуют в виде прокаспазы (неактивной версии протеазы), которая должна быть протеолитически расщеплена для проявления протеазной активности.
Белки семейства IAP (ингибиторы апоптоза) блокируют апоптоз либо путем предотвращения расщепления прокаспазы, либо путем прямого ингибирования активности каспаз.

Субклеточная локализация протеаз также может контролировать их активность. Некоторые протеазы изолированы внутри определенных органелл, так что они могут расщеплять только те белки, которые нацелены на эти органеллы.
Например, катепсины представляют собой протеазы, локализованные преимущественно в лизосомах.
Эти протеазы расщепляют белки, нацеленные на лизосомы.
В интактных клетках белки, не локализованные в лизосомах, не вступают в контакт с катепсинами и, следовательно, не подвергаются ими протеолизу.

Протеолиз при выделении белка
Когда клетки лизируются, регуляторные механизмы нарушаются, и органеллы могут разрушаться.
Таким образом, будут устранены клеточные механизмы ингибирования протеазы или секвестрации протеазы.
Обычно секвестрированные протеазы могут затем воздействовать на белки, с которыми они обычно не вступают в контакт.
Ранее неактивные протеазы могут активироваться и начать расщеплять различные белки.
Из-за огромного количества и типов протеаз, присутствующих в организмах, обычно используемых для экспрессии белков (таблица 1), легко представить, что представляющие интерес белки могут подвергаться обширному протеолизу при лизисе клеток.

Из-за этой потенциальной нежелательной протеазной активности необходимо принять меры для предотвращения протеолиза во время протоколов выделения белка.
Как правило, только после этого можно выделить полноразмерный функциональный белок для использования в экспериментальных исследованиях.
Ингибиторы протеаз обычно используются в таких исследованиях, и тип используемого ингибитора (ингибиторов) зависит от типов протеаз, которые необходимо ингибировать.

Классификация протеаз
Протеазы можно классифицировать по их механизму действия и субстратной специфичности.

Основная классификация
В широком смысле протеазы можно охарактеризовать как эндопептидазы или экзопептидазы.
Эндопептидазы расщепляют связи внутри белка и обычно очень специфичны для определенных аминокислотных последовательностей.
Экзопептидазы отщепляют одну аминокислоту от конца белка и менее специфичны по отношению к отщепляемой аминокислоте.
Экзопептидазы сами по себе классифицируются как те, которые отщепляются только от С-конца (карбоксипептидазы), только от N-конца (аминопептидазы) или от обоих концов (дипептидазы).
Как эндопептидазы, так и экзопептидазы могут быть очень проблематичными при очистке белков.
Эндопептидазы могут распознавать участки в интересующем белке и выполнять протеолиз, чтобы расщепить белок на множество более мелких фрагментов, которые бесполезны в экспериментальных исследованиях.
Экзопептидазы могут удалять всего несколько аминокислот, что может сильно влиять на функцию белка, но часто не обнаруживается обычными методами.

Механизм протеолиза
Протеазы также характеризуются своим механизмом действия; то есть аминокислоты, которые участвуют в каталитическом сайте фермента.
Каталитический сайт содержит аминокислоты, которые непосредственно участвуют в гидролизе пептидной связи (рис. 1).
Этот процесс требует, чтобы нуклеофил инициировал реакцию, которая может быть либо боковой цепью аминокислоты активного центра, либо молекулой воды.
На более поздних стадиях протеолиза две части гидролизованного белка высвобождаются, и активный центр протеазы возвращается в исходное состояние, готовый к связыванию другого субстрата для протеолиза.

Протеазы обычно группируются в четыре основных класса на основе их остатков в активном центре: сериновые протеазы, цистеиновые (тиоловые) протеазы, аспарагиновые протеазы и металлопротеазы.
Сериновые и цистеиновые (тиоловые) протеазы имеют аминокислоту в активном центре, которая выполняет начальную нуклеофильную атаку, в то время как аспарагиновые протеазы и металлопротеазы активируют молекулу воды для выполнения начальной нуклеофильной атаки.

Сериновые протеазы действуют через каталитическую триаду, состоящую из серина, остатка гистидина и остатка аспартата.
Цистеиновые (тиоловые) протеазы содержат каталитическую диаду с остатком гистидина и остатком цистеина.
Цистеин выполняет нуклеофильную атаку, чтобы инициировать гидролиз пептидной связи.
Аспарагиновые протеазы содержат каталитическую диаду с двумя остатками аспартата.
Металлопротеазам требуется ион цинка (или, реже, другой двухвалентный ион металла), который координируется с белком тремя аминокислотами, идентичность которых может варьироваться.
Ион металла активирует молекулу воды, так что она может осуществить нуклеофильную атаку на карбонильный углерод, чтобы разорвать пептидную связь.
Специфичность пептидной связи
Эндопротеазы специфически распознают определенные аминокислоты или типы аминокислот.
Аминокислоты, образующие пептидную связь, а также соседние остатки также могут играть роль в специфичности протеазы.
Это распознавание опосредуется карманом специфичности протеазы, областью внутри протеазы вокруг активного сайта, которая связывает некоторые боковые цепи аминокислот более благоприятно, чем другие. Некоторые из наиболее распространенных протеаз включают следующее:
Трипсиноподобные протеазы преимущественно расщепляют белки по карбоксильной стороне аргинина или лизина (за исключением случаев, когда этот остаток следует за пролином).
Химотрипсиноподобные протеазы преимущественно расщепляют по карбоксильной стороне большие ароматические остатки (триптофан, тирозин или фенилаланин).
Каспазоподобные протеазы преимущественно расщепляют карбоксильную сторону аспартата, но было показано, что одна каспаза у дрозофилы также расщепляет карбоксильную сторону глутамата.
Эластазоподобные протеазы преимущественно расщепляют по карбоксильной стороне небольшие алифатические аминокислоты (глицин, аланин или валин).
Ингибиторы протеазы

Ингибиторы протеаз представляют собой молекулы, которые блокируют активность протеаз и обычно действуют на классы протеаз со схожими механизмами действия. Ингибиторы протеазы могут быть в форме белков, пептидов или небольших молекул.
Встречающиеся в природе ингибиторы протеазы обычно представляют собой белки или пептиды.
Ингибиторы протеазы, используемые в экспериментальных исследованиях или при разработке лекарств, часто представляют собой синтетические пептидоподобные или небольшие молекулы.
Многие различные ингибиторы протеазы коммерчески доступны для экспериментального использования как в анализах in vitro, так и in vivo, а также во время очистки белков.
Механизмы ингибирования протеазы
Ингибиторы протеаз могут работать по-разному, подавляя действие протеаз.
Эти ингибиторы можно классифицировать по типу протеаз, которые они ингибируют, и по механизму, с помощью которого они ингибируют этот фермент.
Хотя коммерческие ингибиторы протеаз обычно продаются в зависимости от класса протеаз, которые они ингибируют, понимание различных механизмов действия ингибиторов необходимо для всестороннего понимания ингибирования и разработки ингибиторов протеаз в качестве терапевтической стратегии.

Обратимые ингибиторы обычно связываются с протеазой посредством множественных нековалентных взаимодействий без какого-либо изменения самого ингибитора. Эти ингибиторы могут быть удалены путем разбавления или диализа.
К обратимым ингибиторам относятся конкурентные ингибиторы, неконкурентные ингибиторы и неконкурентные ингибиторы.

Конкурентный ингибитор связывается с активным центром протеазы, конкурируя с субстратами за доступ к остаткам активного центра.
Одним из примеров конкурентного ингибитора является апротинин, который ингибирует многие сериновые протеазы.
Конкурентные ингибиторы часто сходны по структуре с переходным состоянием природных субстратов.
Переходное состояние субстрата представляет собой промежуточное состояние структуры, которое обычно наиболее прочно связывается с ферментом.
Поэтому соединения, имитирующие эту структуру, связываются с ферментом с большей силой, чем может субстрат (в его исходном состоянии), и, таким образом, нормальная ферментативная реакция не может протекать.

Примером аналога переходного состояния этого типа является LP-130, ингибитор протеазы ВИЧ-1.
Неконкурентные ингибиторы связываются с протеазой только тогда, когда она уже присоединена к субстрату.
Неконкурентные ингибиторы были идентифицированы для протеазы ВИЧ-1 и протеиназы NS2B-NS3 вируса Западного Нила.
Неконкурентные ингибиторы связываются с протеазой с одинаковой аффинностью, независимо от наличия связанного субстрата.
Эти молекулы ингибируют активность протеазы по аллостерическому механизму. Примерами неконкурентных ингибиторов являются BBI, ингибитор трипсина из соевых бобов и аминогликозиды, ингибиторы протеазы летального фактора сибирской язвы.
Необратимые ингибиторы функционируют путем специфического изменения активного центра своей специфической протеазы-мишени, часто посредством образования ковалентной связи.
Их правильнее было бы назвать инактиваторами.

При связывании с ингибитором активный центр протеазы изменяется, и она больше не может осуществлять гидролиз пептидной связи.
Некоторые из таких ингибиторов на самом деле не связываются ковалентно с протеазой, а взаимодействуют с таким высоким сродством, что их нелегко удалить.
Независимо от того, является ли ингибирование обратимым или нет, имеет значение при использовании ингибитора: для обратимого ингибитора концентрация ингибитора должна поддерживаться на протяжении всего протокола, например, во время очистки белка, в то время как для необратимого ингибитора после инактивации всех протеаз, нет необходимости поддерживать концентрацию ингибитора.

Ингибиторы суицида, обычно аналоги субстрата, являются необратимыми ингибиторами, которые ковалентно связываются с протеазами.
Примером суицидального ингибитора протеазы является семейство белков серпинов, которые играют роль в свертывании крови и воспалении.
Петля в серпине служит аналогом субстрата.
Остаток серина в активном центре трипсина образует нуклеофильную атаку на карбонильный углерод аналога субстрата, вызывая конформационное изменение фермента, которое делает оставшуюся часть реакции гидролиза пептидной связи неблагоприятной.
Таким образом, серпин остается ковалентно связанным с протеазой, так что фермент больше не может связываться с субстратами.

Коммерческие ингибиторы протеазы
Ингибиторы протеазы можно приобрести по отдельности или в виде концентрированного коктейля, содержащего несколько ингибиторов протеазы в соответствующих концентрациях. Отдельные ингибиторы протеазы идеально подходят для протеолитических анализов уже очищенных белков.
Часто ферментативные анализы требуют контроля, чтобы показать, что интересующий фермент выполняет контролируемое действие; таким образом, добавление специфического ингибитора протеазы может адекватно служить в качестве контроля.
Приобретение отдельных ингибиторов протеазы также может быть полезным, когда очищаемый белок сам является протеазой.
В этом случае наличие функциональных белков и чистоту часто оценивают с помощью ферментативных анализов.
Для этого типа очистки можно добавить несколько ингибиторов протеазы, за исключением тех, которые ингибируют интересующую протеазу.
Перечислены некоторые из наиболее распространенных ингибиторов протеаз, которые используются при очистке белков.
Большинство предлагают широкое ингибирование одного или нескольких классов протеаз.

Коктейли ингибиторов протеазы часто используются из-за их надежности и воспроизводимости.
Коктейли содержат несколько ингибиторов протеазы в соответствующих относительных количествах, что устраняет необходимость проб и ошибок при определении необходимых типов и количеств ингибиторов для использования.
Они также снижают вероятность ошибок, связанных с человеческим фактором или пипетированием, поскольку требуется только одно решение, а не несколько разных.
Эти коктейли бывают как жидкими, так и твердыми.

Ингибиторы протеазы, как по отдельности, так и в виде коктейлей, доступны из ряда коммерческих источников.
MilliporeSigma является одним из крупнейших поставщиков коктейлей ингибиторов и индивидуальных ингибиторов протеазы.
Комплексные таблетки MilliporeSigma (рис. 7) относятся к наиболее часто используемым коктейлям ингибиторов протеазы.
Эти таблетки добавляют к определенному объему буфера для ингибирования наиболее распространенных протеаз.
Было показано, что таблетки MilliporeSigma COMPLETE успешно ингибируют широкий спектр протеаз в лизатах многих организмов, включая кишечную палочку, дрожжи, насекомых и млекопитающих.
Эти таблетки доступны как с ЭДТА, так и без нее.

Ингибиторы протеазы в форме таблеток добавляют к соответствующему объему буфера, и таблетки растворяются, чтобы довести концентрацию каждого ингибитора протеазы до соответствующего уровня.
Добавление ингибиторов протеазы в виде таблеток очень удобно, так как не требуется пипетирование. В тех случаях, когда требуются небольшие объемы буфера, коктейли ингибиторов протеазы в жидкой форме могут быть более подходящими, чтобы избежать потери избытка буфера или ингибиторов, поскольку таблетки требуют приготовления заданного объема.

EMD Millipore продает различные коктейли ингибиторов протеазы Calbiochem для различных целей.
Компоненты этих коктейлей указаны на их веб-сайте и могут помочь потребителям выбрать, какой продукт лучше всего подходит для их применения.
Доступны коктейли, ингибирующие несколько классов протеаз, и коктейли, разработанные для ингибирования широкого спектра протеаз одного класса. Обычно они поставляются в ДМСО или в виде лиофилизированного порошка, который можно восстановить для получения концентрированного маточного раствора.

Компания Thermo Scientific продает коктейли с ингибиторами протеазы как в жидкой, так и в таблетированной форме. Halt Protease Inhibitor Cocktail — это 100-кратный раствор, стабильный при 4°C.
Он содержит комбинацию AEBSF, апротинина, бестатина, Е-64, лейпептина и пепстатина А, растворенных в ДМСО.
Флакон ЭДТА предоставляется для варианта ингибирования металлопротеазы. Одна и та же комбинация ингибиторов протеазы продается в форме таблеток как с ЭДТА, так и без нее.

G-Biosciences продает смесь ингибиторов протеазы, которая совместима с масс-спектрометрией и двумерным гель-электрофорезом.
Этот коктейль содержит ингибиторы протеаз, проявляющие широкое ингибирование, и включает альтернативу ЭДТА для ингибирования металлопротеаз.
Recom ProteaseArrest™ — это коктейль, специально предназначенный для очистки меченных гистидином белков, экспрессируемых в бактериях.
Другие составы ProteaseArrest™ доступны от G-Biosciences для белков, выделенных из различных типов организмов, и эти составы содержат различные количества ингибиторов в зависимости от относительного количества различных протеаз в организмах.
Точно так же MilliporeSigma продает коктейли ингибиторов протеазы, которые, как сообщается, оптимизированы для экстрактов тканей/клеток млекопитающих, экстрактов тканей/клеток растений, экстрактов клеток грибов/дрожжей и белков, секретируемых млекопитающими.

Многие другие компании также продают ингибиторы протеазы по отдельности, в виде коктейлей и наборов из нескольких отдельных ингибиторов.
Эти наборы полезны для определения того, какие ингибиторы протеазы необходимы для определенного применения.
Они также могут быть полезны, когда известно, что конкретный ингибитор протеазы, включенный в большинство коммерческих коктейлей, препятствует интересующему белку или последующему применению.
Sigma Aldrich, GE Healthcare, Promega, Cell Signaling Technology, Clontech и Santa Cruz Biotechnology, Inc. продают ингибиторы протеазы в различных формах.

Ингибирующие протеазу антитела
Селективное подавление микробных протеаз может быть достигнуто применением моноклональных антител.
Недавно был продемонстрирован новый подход к получению ингибирующих протеазу антител путем селективного превращения.
Авторы исследования использовали двухцветную проточную цитометрию для проведения селекции на матриксной металлопротеиназе (ММР)-9 и встречной селекции на каталитических доменах ММР-14.
Результаты показали успешное превращение антител, ингибирующих ММП-14, в антитела, ингибирующие ММП-9, с высокой селективностью.

В другом исследовании описан функциональный отбор ингибирующих протеазу антител, основанный на совместной экспрессии рекомбинантных белков в Escherichia coli, интересующей протеазы и β-лактамазы с расщепляемой протеазой пептидной последовательностью.
Было получено несколько антител, подавляющих различные протеазы, такие как матриксные металлопротеиназы, бета-секретазу 1 и катепсин В.
Ингибирующие протеазу антитела оказались эффективными как в клеточных анализах, так и в моделях на животных.

Новые ингибиторы протеазы
В недавнем исследовании описано выделение и характеристика PPF-BBI, нового ингибитора протеазы, полученного из кожного секрета желтополосой прудовой лягушки Фукиен, Pelophlax plancyi fukienesis.
Соединение проявляло антимикробную активность в отношении C aureus, C albicans и E coli.

В другом исследовании был представлен GP205, новый ингибитор протеазы NS3/4Aserine с низкой наномолярной активностью против нескольких репликонов вируса гепатита С (HCV). Анализ фармакокинетики GP205 продемонстрировал удлинение периода полувыведения из плазмы.
Этот ингибитор сериновой протеазы может быть полезен для разработки новых методов лечения ВГС.

Недавно был проведен скрининг библиотеки флавоноидов для выявления соединений, способных подавлять 3C-подобную протеазу MERS-CoV (3CLpro), вырабатываемую коронавирусом ближневосточного респираторного синдрома.
Было показано, что флавоноиды гербацетин, изобавачалкон, кверцетин 3-β-d-глюкозид и гелихризетин снижают активность 3CLpro и поэтому могут применяться для разработки новых подходов к лечению коронавируса.

Обычно используемые ингибиторы протеазы в лабораторных экспериментах
Labome вручную просматривает официальные публикации на предмет используемых реагентов.
перечислены часто упоминаемые ингибиторы протеазы. Очень часто используются коктейли с ингибиторами протеазы.
Почти в половине публикаций, изученных Labome, упоминается коктейль ингибиторов протеазы MilliporeSigma.
Litke JL et al., например, включили смесь ингибиторов протеазы и фосфатазы Halt от Thermo Fisher (78440) в буфере RIPA для лизиса клеток Hela для вестерн-блоттинга.

Ингибиторы протеазы в действии
Есть много вещей, которые следует учитывать при выборе подходящего ингибитора протеазы для конкретного процесса.
Наиболее важным фактором является цель ингибирования протеазы — нужны ли ингибиторы для предотвращения протеолиза во время очистки белка, для ингибирования очищенного фермента в качестве экспериментального контроля или для использования в живых организмах для воздействия на физиологические процессы.
В следующем разделе приведены некоторые основные вопросы и опасения, которые следует учитывать при использовании ингибиторов протеазы.

Какой ингибитор протеазы следует использовать?
Приложение играет важную роль в типе ингибиторов протеазы, которые следует использовать.
Для анализов in vitro и in vivo выбор ингибитора протеазы зависит от конкретного изучаемого фермента или физиологического процесса.
Для ферментативных анализов ингибитор не должен мешать методу обнаружения.
Хотя, если ингибирование является обратимым и доступен другой метод обнаружения (например, ELISA), может не иметь значения, ингибируется ли целевой белок во время очистки, при условии, что ингибитор отсутствует в конечном препарате.
Протеазы Следует отметить, что некоторые ингибиторы протеаз не специфичны для протеаз.
Например, PMSF необратимо ингибирует многие, но не все члены семейства серингидролаз.
Это семейство включает протеазы, такие как трипсин и химотрипсин, но также включает большое количество других ферментов, которые гидролизуют небелковые субстраты (например, ацетилхолинэстеразы, ацил-КоА-гидролазы и липазы).
Для исследований на живых организмах ингибиторы должны быть проницаемыми для клеток, высокоспецифичными и нетоксичными.
Для широкого ингибирования протеаз, чтобы помочь в очистке полноразмерного функционального белка, обычно требуется несколько протеаз.

Как следует готовить и хранить ингибиторы протеазы?
Многие ингибиторы протеазы нестабильны в течение длительного времени ни в виде маточного раствора, ни в рабочей концентрации. Крайне важно готовить растворы в соответствии с инструкциями производителя, поскольку некоторые ингибиторы протеазы более стабильны при определенных условиях, чем другие.
Как правило, если исходные растворы хранились в соответствии с рекомендациями, а рабочие растворы готовились непосредственно перед использованием, ингибиторы должны сохранять достаточную функцию. Однако некоторые ингибиторы протеазы, такие как PMSF, очень нестабильны, и их может потребоваться многократное добавление во время лизиса и очистки, чтобы обеспечить ингибирование протеазы.

Как можно подтвердить функцию ингибиторов протеазы?
Несколько компаний продают реагенты для проверки функции протеазы, и их можно использовать для подтверждения адекватного ингибирования.
MilliporeSigma продает универсальный протеазный субстрат, в котором используется анализ на основе абсорбции для мониторинга деградации меченого резоруфином казеина.
Этот субстрат можно использовать, если есть основания подозревать неадекватное ингибирование протеазы.
Другие компании, такие как Calbiochem (EMD Millipore), продают аналогичные реагенты.
Как правило, лучше использовать время и энергию для приготовления свежего раствора ингибитора протеазы, если есть подозрение, что протеазы не были хорошо ингибированы. Однако, если протеолиз является повторяющейся проблемой, эти коммерческие субстраты могут помочь в определении более подходящих условий для ингибирования протеазы.

Когда при лизисе клеток и очистке белков следует добавлять ингибиторы протеазы?
Ингибиторы протеаз следует добавлять в буфер для лизиса, чтобы ингибирование начиналось сразу после лизиса клеток, когда протеазы высвобождаются из своих клеточных компартментов или их регуляция нарушена иным образом.
Эти ингибиторы протеаз должны оставаться в буферах, используемых в схеме очистки, до тех пор, пока большая часть загрязняющих протеаз не будет достаточно отделена от интересующего белка.
Как правило, если первая хроматографическая стадия является строгой (например, аффинная хроматография), ингибиторы протеазы должны присутствовать только на стадии промывки этой хроматографической процедуры.
Буфер для элюции и оставшиеся буферы для очистки обычно не требуют ингибиторов протеазы.
Это важное финансовое соображение для крупномасштабных усилий по очистке белка, где может потребоваться большое количество буферов; включение высоких концентраций ингибиторов протеазы во время крупномасштабной очистки может быть непомерно дорогим.

Однако многие протеазы являются очень эффективными катализаторами с высоким числом оборотов, и поэтому, если даже небольшое количество протеазы очищается совместно с целевым белком, это может вызвать проблемы.
Это может привести к явной деградации целевого белка или может быть неочевидным до тех пор, пока N-концевой или масс-спектроскопический анализ не покажет, что очищенный белковый препарат содержит различные соединения с разными N-концами.
Для многих приложений такая микронеоднородность может не быть проблемой, но для других она может вызвать серьезные проблемы.
Например, в контексте структурной биологии такая N-концевая гетерогенность может влиять на способность к кристаллизации белка и/или на качество любых полученных кристаллов.
Таким образом, в некоторых случаях может оказаться необходимым включить ингибиторы против одного или нескольких классов протеаз на более поздних стадиях протокола очистки.
Использование анализов протеазы (как обсуждалось выше) можно использовать для идентификации класса(ов) протеазы, который необходимо заблокировать.

Что еще можно сделать для замедления протеолиза?
Лизис и очистку клеток следует проводить при низкой температуре.
Обычно лизис и очистку проводят на льду или при 4°С.
Это не только способствует сворачиванию и стабильности белка, но также замедляет скорость протеолиза за счет загрязнения протеазами.
Кроме того, чем быстрее загрязняющие протеазы удаляются из интересующего белка, тем меньше времени у них есть для взаимодействия с интересующими белками и, возможно, для их деградации.
Не оставляйте лизаты клеток на промежуточных этапах в течение длительного времени, даже на льду.
Пройдите этапы очистки как можно быстрее, чтобы удалить как можно больше протеаз и надлежащим образом сохранить очищенный белок.

Если протеолиз рекомбинантного белка представляет собой особую проблему, можно рассмотреть несколько подходов.
Для экспрессии E.coli возможно, что снижение температуры роста уменьшит протеолиз целевого белка, который происходит до сбора и лизиса клеток.
Также возможно снизить внутриклеточный протеолиз целевого белка путем направления экспрессии в периплазму и, таким образом, снижения воздействия внутриклеточных протеаз.
Точно так же, чтобы избежать протеолиза внутриклеточными протеазами млекопитающих, можно использовать систему экспрессии, которая запускает секрецию рекомбинантного белка в культуральную среду.
Принимая во внимание различный спектр протеаз, продуцируемых разными организмами, можно также уменьшить или даже устранить проблемы протеолиза путем переключения экспрессии на другой организм-хозяин (например, E. coli на бакуловирус/клетки насекомых).

Если я не знаю, какие ингибиторы протеазы использовать, с чего мне начать?
Лучше всего начать выбор правильной комбинации ингибиторов протеазы для использования во время лизиса клеток и очистки белка, чтобы попробовать обычно используемый коктейль ингибиторов протеазы.
Для большинства лизатов и применений этого достаточно.
Однако, если полноразмерный белок не получен или возникают проблемы с последующими приложениями, можно использовать специфические ингибиторы протеазы или наборы ингибиторов протеазы для определения наиболее подходящей комбинации ингибиторов протеазы.

Ингибиторы протеазы в клинической практике
Ингибиторы протеазы прошли доклинические и клинические испытания.
Показано, что супрессоры конвертазы субтилизин-кексин 9 типа снижают уровень липопротеинов низкой плотности и одобрены для лечения больных с выраженной гиперлипидемией.
Супрессоры дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4) эффективно снижают уровень глюкозы и используются для лечения пациентов с диабетом 2 типа.
Было показано, что ингибитор ДПП-4 линаглиптин подавляет развитие диабетической ретинопатии в экспериментальной модели.
Рекомбинантный ингибитор сериновой протеазы (rBmTI-A) был оценен на мышиной модели аллергического воспаления легких.

Протеолитическая активность, полиморфно-ядерные и эозинофильные ответы и продукция провоспалительных цитокинов снижались при лечении rBmTI-A в легких мышей Balb/c, что предполагает потенциальное применение этого ингибитора протеазы для терапии астмы.
Кроме того, влияние ингибитора протеазы MG-132 на сепсис-индуцированное повреждение легких было изучено с использованием модели крыс Sprague Dawley.
Авторы обнаружили, что MG-132 защищает от острого повреждения легких посредством ингибирования пути mTOR/4EBP1/EIF4E.
Кроме того, недавно было оценено влияние ингибитора секреторной лейкоцитарной протеазы (SLPI) на плоскоклеточный рак (SCC).
Исследование показало, что SLPI подавляет фенотипы, опосредованные вирусом папилломы человека, в клетках SCC посредством усиления сигнального пути NF-κB. Ингибиторы цистеиновой протеазы катепсина К повышают минеральную плотность костной ткани у лиц с постменопаузальным остеопорозом.
Показано, что супрессор катепсина К оданакатиб снижает резорбцию кости как у мужчин, так и у женщин с остеопорозом.