HPAA

CAS No.: 23783-26-8
EC No.: 405-710-8

Synonyms:
HPAA; hpaa; Acetic acid, 2-hydroxy-2-phosphono- [ACD/Index Name]; Acetic acid, hydroxyphosphono-; Acide hydroxy(phosphono)acétique [French] [ACD/IUPAC Name]; Hydroxy(phosphono)acetic acid [ACD/IUPAC Name]; Hydroxy(phosphono)essigsäure [German] [ACD/IUPAC Name]; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; 115469-15-3 [RN]; 153733-51-8 [RN]; 23783-26-8 [RN]; 2-Hydroxy phosphono acetic acid; 2-Hydroxy-2-phosphonoacetic acid; 2-hydroxyphosphonoacetic acid; 2-Hydroxyphosphonocarboxylic Acid; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; 2-phosphoglycolic acid; ACETIC ACID 2-HYDROXY-2-PHOSPHONO-; HPAA; Hydroxyphosphono-acetic acid; Hydroxyphosphono-acetic acid|2-Hydroxy phosphono acetic acid|HPAA; MFCD01940970; MFCD20638215; Phosphoglycolic acid; PHOSPHONOGLYCOLIC ACID; α-Hydroxyl phosphonoacetic acid; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; α-Hydroxyphosphonoacetic acid; 2-Hydroxy-2-phosphono-acetic acid; 2-hydroxy-2-phosphonoacetic acid; 2-hydroxy-2-phosphono-ethanoic acid; Acetic acid, hydroxyphosphono-; alpha.-Hydroxyl phosphonoacetic acid; alpha.-Hydroxyphosphonoacetic acid; HPA; HPAA; HPSE; HPSE1; Belcor 575; Heparanase-1; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; Snailagglutinin; Endo-glucoronidase; Phosphonoglycolic acid; Heparanase [Precursor]; Hydroxyphosphonoacetic acid; Acetic acid, hydroxyphosphono-; 2-[hydroperoxy(hydroxy)phosphoryl]acetic acid; 2-(Hydroperoxy(hydroxy)phosphoryl)acetic acid; hydroxyphosphono acetic acid; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; SCHEMBL560738; ZINC100443591; DB-029902; Hydroxyphosphono-acetic acid; 2-Hydroxy phosphono acetic acid; HPA; HPAA; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; Hydroxyphosphono-acetic acid; N-HEXYLPHOSPHONIC ACID; LABOTEST-BB LT00408920; hpaa; n-Hexylphosphonicacid,min.97%; 2-Hydroxyphosphonocarboxylic Acid; 2-Hydroxy Phosphonoacetic Acid; 2-Hydroxy Phosphonic Acetic AcidStructure; hexylphosphonic acid; hexylphosphonate; Acetic acid, 2-hydroxy-2-phosphono-; 2-hydroxy-2-phosphonoacetic acid; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; 2-Hydroxyphosphonoacetic Acid; 2-hydroxy-2-phosphono-acetic acid; Phosphono-hydroxy-acetic acid; SCHEMBL254667; 2-Hydroxyphosphonocarboxylic Acid; CTK1A2951; DTXSID40865115; .alpha.-Hydroxyphosphonoacetic acid; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; .alpha.-Hydroxyl phosphonoacetic acid; AKOS015892863; VZ34695; FT-0694552; EC 405-710-8; 2-Hydroxy-2-phosphonoacetic acid 23783-26-8; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; Acetic acid, 2-hydroxy-2-phosphono- [ACD/Index Name]; Acetic acid, hydroxyphosphono-; Acide hydroxy(phosphono)acétique [French] [ACD/IUPAC Name]; Hydroxy(phosphono)acetic acid [ACD/IUPAC Name]; Hydroxy(phosphono)essigsäure [German] [ACD/IUPAC Name]; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; 115469-15-3 [RN]; 153733-51-8 [RN]; 23783-26-8 [RN]; 2-Hydroxy phosphono acetic acid; 2-Hydroxy-2-phosphonoacetic acid; 2-hydroxyphosphonoacetic acid; 2-Hydroxyphosphonocarboxylic Acid; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; 2-phosphoglycolic acid; ACETIC ACID 2-HYDROXY-2-PHOSPHONO-; HPAA; Hydroxyphosphono-acetic acid; Hydroxyphosphono-acetic acid|2-Hydroxy phosphono acetic acid|HPAA; MFCD01940970; MFCD20638215; Phosphoglycolic acid; PHOSPHONOGLYCOLIC ACID; α-Hydroxyl phosphonoacetic acid; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; α-Hydroxyphosphonoacetic acid; 2-Hydroxy-2-phosphono-acetic acid; 2-hydroxy-2-phosphonoacetic acid; 2-hydroxy-2-phosphono-ethanoic acid; Acetic acid, hydroxyphosphono-; alpha.-Hydroxyl phosphonoacetic acid; alpha.-Hydroxyphosphonoacetic acid; HPA; HPAA; HPSE; HPSE1; Belcor 575; Heparanase-1; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; Snailagglutinin; Endo-glucoronidase; Phosphonoglycolic acid; Heparanase [Precursor]; Hydroxyphosphonoacetic acid; Acetic acid, hydroxyphosphono-; 2-[hydroperoxy(hydroxy)phosphoryl]acetic acid; 2-(Hydroperoxy(hydroxy)phosphoryl)acetic acid; hydroxyphosphono acetic acid; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; SCHEMBL560738; ZINC100443591; DB-029902; Hydroxyphosphono-acetic acid; 2-Hydroxy phosphono acetic acid; HPA; HPAA; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; Hydroxyphosphono-acetic acid; N-HEXYLPHOSPHONIC ACID; LABOTEST-BB LT00408920; hpaa; n-Hexylphosphonicacid,min.97%; 2-Hydroxyphosphonocarboxylic Acid; 2-Hydroxy Phosphonoacetic Acid; 2-Hydroxy Phosphonic Acetic AcidStructure; hexylphosphonic acid; hexylphosphonate; Acetic acid, 2-hydroxy-2-phosphono-; 2-hydroxy-2-phosphonoacetic acid; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; 2-Hydroxyphosphonoacetic Acid; 2-hydroxy-2-phosphono-acetic acid; Phosphono-hydroxy-acetic acid; SCHEMBL254667; 2-Hydroxyphosphonocarboxylic Acid; CTK1A2951; DTXSID40865115; .alpha.-Hydroxyphosphonoacetic acid; HPAA; hpaa; HPAA; hpaa; .alpha.-Hydroxyl phosphonoacetic acid; AKOS015892863; VZ34695; FT-0694552; EC 405-710-8; 2-Hydroxy-2-phosphonoacetic acid 23783-26-8; HPAA; hpaa

HPAA

АННОТАЦИЯ
Инфекция, вызванная возбудителем желудочного сока человека Helicobacter pylori, может вызвать хронический гастрит, язвенную болезнь и рак желудка. Все штаммы H. pylori экспрессируют поверхностно-локализованный белок HpaA, многообещающий кандидат для вакцины против инфекции H. pylori. Для изучения физиологического значения HpaA мутация гена hpaA была введена в адаптированный к мышам штамм H. pylori. Чтобы обосновать, что прерывание гена hpaA не вызывало каких-либо полярных эффектов нижестоящих генов или было связано с мутацией второго сайта, паттерны экспрессии белка мутантных штаммов и штаммов дикого типа были охарактеризованы двумя различными протеомными подходами. Двумерный дифференциальный гель-электрофорез экстрактов целых клеток и субклеточное фракционирование в сочетании с наножидкостной хроматографией - масс-спектрометрией с ионным циклотронным резонансом с преобразованием Фурье для определения профиля белков внешней мембраны выявили лишь незначительные различия в профиле белков между мутантными и дикими штаммы -типа. Таким образом, мутантный штамм был протестирован на его колонизирующую способность на хорошо известной мышиной модели. В то время как инокуляция штаммом дикого типа привела к сильно инфицированным H. pylori мышам, мутантный штамм HpaA не смог установить колонизацию. Таким образом, объединив протеомный анализ и исследования in vivo, мы пришли к выводу, что HpaA необходим для колонизации H. pylori у мышей.

Адгезин A H. pylori (HpaA) - это поверхностно-расположенный (7, 14, 20) липопротеин (25), который первоначально был описан как адгезин, связывающий сиаловую кислоту, но подтверждающих данных до сих пор нет. Он распознается антителами от людей, инфицированных H. pylori (23, 39), и ранее было обнаружено, что экспрессия белка HpaA высоко консервативна среди изолятов H. pylori (9, 39). Кроме того, геномные исследования (2, 32) не показывают значительной гомологии последовательностей HpaA с другими известными белками. Все вместе это делает HpaA предполагаемым кандидатом в качестве вакцинного антигена против инфекции H. pylori.

В этом исследовании мы сконструировали мутант HpaA в адаптированном к мышам штамме H. pylori Sydney 1 (SS1), чтобы изучить роль HpaA в колонизации. Из-за котранскрипции мутации сконструированного гена могут вызывать полярные эффекты, то есть подавлять экспрессию нижележащих генов в опероне. Кроме того, было показано, что отключение одного гена может непредсказуемо повлиять на другие гены (30). Таким образом, при изучении мутанта протеомный анализ предлагает удобный метод мониторинга изменений экспрессии белка без предварительного знания того, какими могут быть эти изменения.

Первой целью этого исследования было изучить общий профиль белка, включая экспрессию белков генов, расположенных ниже hpaA, адаптированного к мышам штамма SS1 и его изогенного мутанта HpaA. Это было достигнуто с помощью протеомного подхода, при котором экстракты целых клеток бактерий сравнивали с помощью анализа DIGE. Мы также объединили субклеточное фракционирование и одномерный электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS) (PAGE) с нано-ЖХ с преобразованием Фурье (FT) с ионно-циклотронным резонансом (ICR) (FT-ICR) MS и тандемным MS (MS / MS) для сравнения профилей OMP SS1 дикого типа и мутантных штаммов. Чтобы определить, важен ли HpaA для выживания в организме хозяина, мышей инфицировали либо SS1 H. pylori, либо мутантным штаммом HpaA, и уровни колонизации

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Конструирование SS1 hpaA-отрицательного / дефицитного мутанта SS1 (ΔhpaA).
Мутант hpaA был первоначально сконструирован в штамме H. pylori CCUG 17874 путем двухэтапной амплификации, приводящей к делеции гена hpaA длиной 450 п.н. (любезно предоставлен P. Doig et al., Исследовательский центр Astrazeneca, Бостон, Массачусетс) и вставка кассеты канамицина размером 1,4 т.п.н. (25). Мутация была перенесена из CCUG 17874 H. pylori в адаптированный к мышам штамм SS1 путем естественной трансформации. Пять трансформантов, устойчивых к канамицину, были проанализированы с помощью ПЦР с двумя HpaA-специфическими праймерами (прямой праймер, 5'-GGCGTAGAAATGGAAGCG-3 '; обратный праймер, 5'-CCCAAGCTTCATCAGCCCTTAAATACACACG-3') (21), чтобы подтвердить, что кассета канамицина была вставлена ​​в ген hpaA, что приводит к большему количеству продукта ПЦР, чем у штамма SS1 дикого типа. Один из трансформантов с правильной вставкой был дополнительно охарактеризован с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с моноклональным антителом HP30-1: 1: 6, специфичным для HpaA (9). Этот штамм SS1 (ΔhpaA) был отрицательным в иммуноблоттинге.

Штаммы и условия культивирования.
Адаптированные к мышам штаммы H. pylori SS1 (CagA + VacA + Ley) (19) и SS1 (ΔhpaA) использовали во всех экспериментах и ​​хранили при -70 ° C в качестве исходных культур. Для получения антигенов из SS1 и SS1 (ΔhpaA) бактерии выращивали на чашках с агаром Colombia-Iso до слияния в течение 3 дней в микроаэрофильных условиях (10% CO2, 6% O2 и 84% N2). SS1 (ΔhpaA) культивировали таким же образом, как и SS1 на протяжении всего эксперимента, за исключением культур, в которые добавляли 25 мкг / мл кан.амицин.

Кривые роста.
SS1 и SS1 (ΔhpaA) сначала выращивали на чашках Colombia-Iso до слияния в течение 2-3 дней, а затем ресуспендировали в 2 мл бульона Brucella (Difco Laboratories) до оптической плотности 0,3 при 600 нм (OD600) (1,5 × 109 бактерий). / мл). Шестнадцать самок мышей C57BL / 6 были перорально инфицированы приблизительно 109 КОЕ SS1 или SS1 H. pylori (ΔhpaA) в бульоне Brucella под анестезией (Isoflurane; Abbott Scandinavia Ab, Solna, Швеция), как описано ранее (27).

Обнаружение SS1 H. pylori (дикий тип) и SS1 (ΔhpaA) у инфицированных мышей. (i) Количественная культура.
Кинетика SS1 при колонизации мышей была хорошо охарактеризована, показывая стабильную колонизацию между 2 и 8 неделями инфекции (27). Для определения кинетики колонизации SS1 (ΔhpaA) у мышей животных умерщвляли в различные моменты времени после заражения (3 дня, 3 недели и 8 недель). Желудки были удалены и промыты забуференным фосфатом физиологическим раствором для удаления остатков пищи. Одну половину желудка использовали для количественного культивирования, как описано ранее (27), а другую половину использовали для обнаружения генов, специфичных для H. pylori, с помощью ПЦР. Гомогенаты желудка мышей, инфицированных SS1 (ΔhpaA), культивировали на чашках с кровью Skirrow как с канамицином, так и без него, чтобы проверить, потеряли ли они свою устойчивость к антибиотикам во время желудочной инфекции.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Сравнение основных протеомных компонентов у штаммов H. pylori SS1 и SS1 (ΔhpaA).
Чтобы определить, что за конструированием мутанта HpaA не последовало никаких изменений в экспрессии специфического белка, мы проанализировали протеом штамма SS1 H. pylori и его изогенный мутант с помощью системы DIGE на основе 2-DE. Благодаря использованию буфера для лизиса клеток, совместимого с технологией DIGE, и изоэлектрической фокусировки при интервале pH от 3 до 10, более 800 различных белковых пятен из каждого образца в четырех повторностях были обнаружены программным обеспечением DeCyder и последующей ручной коррекцией. Анализ профилей экспрессии у штамма SS1 и мутанта SS1 (ΔhpaA) привел к выявлению небольшого количества пятен (13) со значительно измененным уровнем (P <0,05). Было обнаружено, что восемь из этих пятен имеют пониженную регуляцию, а пять пятен имеют повышенную регуляцию у мутанта SS1 (ΔhpaA) (Рис. (Рис. 1). Для идентификации белков один препаративный гель окрашивали Sypro ruby, пятна расщепляли в геле и анализировали с помощью нано-LC FT-ICR MS и MS / MS. Мы успешно идентифицировали белки, представленные в Таблице 1.1. Примечательно, что триггерный фактор, кодируемый геном tig, расположенным ниже hpaA, показал сходные уровни экспрессии в обоих штаммах (рис. (Рис. 11 и 2) .2). Однако Omp18 (HP0796) не был обнаружен ни в штамме дикого типа, ни в мутанте. Таким образом, чтобы убедиться, что нарушение гена hpaA не повлияло на транскрипцию его нижележащего гена, omp18, была проведена omp18-специфическая ОТ-ПЦР на SS1 и мутантном штамме SS1 (ΔhpaA), которая показала, что Omp18 транскрибируется в оба штамма (данные не показаны).

Обнаружение бактерий у инфицированных мышей.
Колонизацию H. pylori выявляли как с помощью количественной культуры, так и с помощью специфичной для H. pylori ПЦР. Чтобы оценить образец колонизации для SS1 (ΔhpaA), мышей инфицировали либо SS1 (ΔhpaA), либо SS1 в качестве эталона, а затем умерщвляли в различные моменты времени в диапазоне от 3 дней до 2 месяцев. Мыши, инфицированные SS1, демонстрировали массивную колонизацию во все изученные моменты времени, но бактерии не могли быть обнаружены в желудках мышей, инфицированных SS1 (ΔhpaA) ни при культивировании (рис. (Рис. 5) 5), ни при помощи H. pylori. -специфическая ПЦР в любой момент времени (данные не показаны). Чтобы убедиться, что SS1 (ΔhpaA) не утратил своей устойчивости к канамицину во время колонизации в желудке, бактерии выращивали на чашках с канамицином и без него. Однако после культивирования на чашках без канамицина также не удалось обнаружить бактерий (данные не показаны).

ОБСУЖДЕНИЕ
Многие факторы колонизации и вирулентности были оценены как защитные антигены в исследованиях иммунизации на животных моделях (17, 22). Для того чтобы бактериальный белок считался кандидатным вакцинным антигеном, он предпочтительно должен быть консервативным (т.е. присутствовать во всех штаммах), секретируемым или локализованным на поверхности и иммуногенным (т.е. способным стимулировать иммунную систему). HpaA соответствует всем этим критериям; ген, кодирующий HpaA, присутствует и экспрессируется всеми изолятами H. pylori (9, 39), что указывает на его ценность для бактерии. Кроме того, у субъектов, инфицированных H. pylori, развивается сывороточный ответ антител против HpaA, который снижается после уничтожения бактерии (23, 37), а HpaA вызывает созревание и презентацию антигена дендритных клеток, демонстрируя его иммуногенность (36). Кроме того, было показано, что HpaA экспрессируется как внутриклеточно, так и на бактериальной поверхности (20, 25).

Чтобы исследовать важность HpaA в инфекции H. pylori, ранее описанная мутация HpaA (25) была введена в адаптированный к мышам штамм SS1, и мутантный штамм был протестирован на его способность к колонизации ииммуногенность на хорошо известной модели на животных.

Чтобы убедиться, что мутация не вызвала какого-либо повреждения нижележащих генов или мутаций второго сайта, мы выполнили двухмерный анализ DIGE для изучения общего характера экспрессии белка штамма SS1 H. pylori. Все обнаруженные белковые пятна в штамме дикого типа, за исключением HpaA, были обнаружены в мутантном штамме. Однако 13 пятен, соответствующих 11 уникальным белкам, показали небольшие изменения в уровнях экспрессии у мутанта по сравнению со штаммом дикого типа; из них было обнаружено, что активность семи белков снижена, а четырех белков повышена. Эти идентифицированные белки, по-видимому, не связаны ни на генетическом, ни на функциональном уровне. Кроме того, было показано, что незначительные изменения в уровне экспрессии белка обычно происходят внутри бактериального штамма (35) (E. Carlsohn et al., Неопубликованные данные). Наиболее важным открытием DIGE-анализа дикого типа и его изогенного мутанта было то, что триггерный фактор, кодируемый геном tig, расположенным ниже hpaA, показал сходные уровни экспрессии в обоих штаммах.

Хорошо известно, что OMP имеют тенденцию различаться в стандартном 2-DE, отображающем общий экстракт клеток. Это связано как с плохой растворимостью, так и с низким уровнем экспрессии интересующих белков, и поэтому важно разработать соответствующую процедуру выделения для этого вида белков. Мы выполнили субклеточное фракционирование OMP в сочетании с одномерным анализом PAGE и анализом триптических пептидов с помощью нано-LC FT-ICR и MS / MS. Используя этот новый подход, мы идентифицировали более 20 белков внешней мембраны и 8 белков, связанных со жгутиками, в обоих исследованных штаммах. Все OMP, присутствующие в штамме дикого типа, за исключением HpaA, также экспрессировались в мутантном штамме. Котранскрипция hpaA и нижележащего гена omp18 была описана ранее (20). Поэтому представляло интерес изучить экспрессию продукта гена omp18 в сконструированном мутанте HpaA для изучения возможных полярных эффектов на окружающие гены в мутанте. К сожалению, ни в одном из штаммов белок Omp18 не обнаружен. Однако анализ RT-PCR мРНК omp18 из штаммов дикого типа и мутантных штаммов ясно показал, что omp18 транскрибируется в обоих штаммах, что указывает на то, что разрушение hpaA не оказывает каких-либо полярных эффектов на его нижестоящие гены (данные не показаны). Кроме того, насколько нам известно, белок Omp18 никогда не был обнаружен, что позволяет предположить, что он может не транслироваться, а может присутствовать только на уровне мРНК. Поскольку никаких серьезных различий между двумя штаммами обнаружить не удалось, мы перешли к модели на животных для оценки физиологического значения HpaA.

Исследования in vivo показали, что, хотя мыши, инфицированные штаммом SS1 дикого типа, были сильно колонизированы, его изогенный мутант не смог колонизировать мышей во все исследуемые моменты времени. Таким образом, тот факт, что мутант не показал значительных различий в росте в лабораторных условиях, предполагает, что наблюдаемый фенотип строго зависит от in vivo.

Первоначально HpaA был назван предполагаемым гемагглютинином, связывающим N-ацетилнейраминиллактозу, и несколько исследований пытались выяснить функцию HpaA в исследованиях адгезии in vitro, но результаты не являются окончательными. Например, связывание бактерий с линиями клеток желудка in vitro не было затронуто инактивированным геном hpaA (25). Однако было продемонстрировано, что линии эпителиальных клеток совершенно иначе реагируют на бактериальную стимуляцию по сравнению со свежевыделенными эпителиальными клетками (4). Кроме того, делеция гена hpaA не влияла на паттерн распознавания гликосфинголипидов бактериями, что было оценено по связыванию бактерий с ранее идентифицированными гликосфинголипидами, связывающимися с H. pylori, на тонкослойных хроматограммах (1). Таким образом, как родительский штамм SS1, так и мутант с нокаутом HpaA связывались с лактозилцерамидом, ганглиотетраозилцерамидом, лактотетраозилцерамидом и гликосфинголипидами с концевыми группами Leb (S. Teneberg et al., Неопубликованные данные). Следовательно, можно предположить, непосредственно ли HpaA непосредственно опосредует связывание рецептора, или он участвует в облегчении транспорта и фолдинга адгезина, или он выполняет регуляторные функции. Роль HpaA необходимо выяснить в дальнейших исследованиях.

В заключение мы показали, что нарушение гена, кодирующего HpaA, не вызывало каких-либо серьезных различий в паттерне экспрессии белка у мутанта по сравнению со штаммом дикого типа. Мы также продемонстрировали, что HpaA важен для бактериальной колонизации слизистой оболочки желудка мышей, впервые установив физиологическую роль HpaA in vivo.

Аннотация
Инфекция, вызванная возбудителем желудочного сока человека Helicobacter pylori, может вызвать хронический гастрит, язвенную болезнь и рак желудка. Все штаммы H. pylori экспрессируют поверхностно-локализованный белок HpaA, многообещающий кандидат для вакцины против инфекции H. pylori. Чтобы изучитьфизиологическое значение HpaA, мутация гена hpaA была введена в адаптированный к мышам штамм H. pylori. Чтобы обосновать, что прерывание гена hpaA не вызывало каких-либо полярных эффектов нижестоящих генов или было связано с мутацией второго сайта, паттерны экспрессии белка мутантных штаммов и штаммов дикого типа были охарактеризованы двумя различными протеомными подходами. Двумерный дифференциальный гель-электрофорез экстрактов целых клеток и субклеточное фракционирование в сочетании с наножидкостной хроматографией - масс-спектрометрией с ионным циклотронным резонансом с преобразованием Фурье для определения профиля белков внешней мембраны выявили лишь незначительные различия в профиле белков между мутантными и дикими штаммы -типа. Таким образом, мутантный штамм был протестирован на его колонизирующую способность на хорошо известной мышиной модели. В то время как инокуляция штаммом дикого типа привела к сильно инфицированным H. pylori мышам, мутантный штамм HpaA не смог установить колонизацию. Таким образом, сочетая протеомный анализ и исследования in vivo, мы делаем вывод, что HpaA необходим для колонизации H.